Purity Analysis of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Proteins using CE-SDS Method

Význam tématu

Adeno-asociovaný virus (AAV) představuje klíčový nástroj pro dodávání genů v oblasti genové terapie díky své nepatogenitě, nízké imunogenicitě a široké tropismu. Kvalitativní i kvantitativní analýza proteinové kapsidy AAV je nezbytná pro zajištění bezpečnosti, stability a konzistence terapeutických přípravků.

Cíle a přehled studie

Cílem práce je demonstrovat využití kapilární elektroforézy se SDS (CE-SDS) na systému SCIEX PA 800 Plus pro vysoce přesné stanovení čistoty tří hlavních kapsidových proteinů VP1 (87 kDa), VP2 (73 kDa) a VP3 (61 kDa). Studie porovnává tento přístup s tradiční SDS-PAGE z hlediska rozlišení, reprodukovatelnosti a kvantitativní odezvy.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku zahrnuje inkubaci AAV vzorce se SDS a 2-merkaptethanolem při 50 °C po dobu 10 min, následné naředění vodou a případnou výměnu pufru ultrafiltračními kolonkami pro odstranění solí nad 40 mM. Instrumentace:

• SCIEX PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis system s PDA detektorem
• EZ-CE kapilární kazeta s 50 µm I.D., 30 cm délky (efektivních 20 cm)
• SDS-MW Analysis Kit (gelový pufr, vzorkový pufr, mycí roztoky)
• 32 Karat™ Software pro akvizici a analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožňuje oddělení VP3, VP2 a VP1 s vysokým rozlišením a konstantním poměrem 8 : 1 : 1 v testovaném AAV8 séru. Opakovatelnost byla hodnocena na osmi po sobě jdoucích vstupech, přičemž RSD CPA% pro všechny tři proteiny zůstaly pod 0,7 %. Linearita odezvy detektoru byla pro titry v rozsahu 5 × 10^11 až 1 × 10^14 GC/mL potvrzena koeficientem R2 = 0,9991. Srovnání vzorků připravených s výměnou pufru i bez ní ukázalo prakticky identické profilové křivky, stejně jako aplikace na AAV2.

Přínosy a praktické využití metody

CE-SDS na PA 800 Plus nabízí:

• Automatizované a méně pracné zpracování oproti SDS-PAGE
• Vyšší reprodukovatelnost a kvantitativní přesnost
• Vysokou citlivost při nižších koncentracích virových vzorků
• Možnost analýzy různých AAV sérotypů se stejným protokolem

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření CE-SDS metodiky na další virové ostatní vektory a sérotypy, integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní molekulární charakterizaci a vývoj vysokoprůtokových QC platforem pro fázi produkce klinických přípravků.

Závěr

Popsaná CE-SDS metoda poskytuje robustní, citlivý a reprodukovatelný nástroj pro kontrolu čistoty AAV kapsidových proteinů. Dokáže nahradit tradiční SDS-PAGE v prostředí farmaceutického výzkumu i rutinní výroby genových terapií.

Reference

1. Zhang C., Meagher M. M. High-resolution capillary electrophoresis analysis of viral proteins. Anal. Chem. 2017, 89, 3285–3292.
2. Quirino J. Modern injection modes for capillary electrophoresis. Encyclopedia of Separation Science 2015, 10.1002/9783527678129.assep035.
3. Stanford University Gene Vector Core. Minimizing viral adhesion with pluronic F68. Med. Stanford.edu, 2020.