Metabolic Profiling of a Corynebacterium glutamicum ΔprpD2 by GC-APCI High Resolution Q-TOF Analysisimpact

Význam tématu

Metabolomická analýza malých molekul nabízí komplexní pohled na biochemické stavy buněk, tkání či organismů. Složitost metabolitů a široké spektrum polárních vlastností vyžadují robustní metody schopné detekovat a identifikovat známé i neznámé sloučeniny.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na metabolické profilování Corynebacterium glutamicum ΔprpD2 před a po pulzním přidání propionátu během exponenciální fáze růstu. Hlavním cílem bylo demonstrovat schopnost GC-APCI-micrOTOF-Q II v kombinaci s vysokým rozlišením MS pro identifikaci biomarkerů, které dosud zůstávají neznámé při použití klasické GC-EI-MS.

Použitá instrumentace

• GC-APCI–micrOTOF-Q II (Bruker Daltonics)
• HP-5MS kapilární kolona (30 m × 0,25 mm i.d., 0,25 µm)
• Software ProfileAnalysis 2.0 a SmartFormula3D

Použitá metodika

• Kultivace C. glutamicum ΔprpD2 na glukóze s pulzním přidáním propionátu; odběr před a 1 h po pulzu
• Metabolitická extrakce, sušení, methoxymace a trimethylsilylace (MSTFA)
• GC teplotní program: 80 °C (3 min) → 325 °C při 5 °C/min; helium flow 1 ml/min; injektor 250 °C
• MS analýza v režimu APCI+, m/z 85–750, 4 spek/s
• Úprava dat: kalibrace, dekonvoluce (Find Molecular Features), normalizace na ribitol, PCA, sumární formule (SmartFormula, SmartFormula3D), databázové dotazy (CompoundCrawler)

Hlavní výsledky a diskuse

PCA jasně rozlišila vzorky před a po aplikaci propionátu na základě karbonových zdrojů. Identifikace 2-methylcitrátní kyseliny využila přesnou hmotnost a isotopický vzor v MS i MS/MS pro vygenerování jediné sumární formule C19H43O7Si4, potvrzené porovnáním se standardem. Další diferenciující sloučeninou byla TMS-derivatizovaná alaninová s sumární formulí C9H24NO2Si2, ověřená standardem.

Přínosy a praktické využití metody

• Zachování prekurzorového iontu pro generování sumární formule
• Vysoké rozlišení a přesnost hmotnosti pro spolehlivou identifikaci
• Rychlé skenovací rychlosti vhodné pro GC vrcholy
• Přechod mezi LC a GC řešen minimálními úpravami

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikačního záběru na další mikrobiální a rostlinné systémy, integrace GC-APCI-HRMS dat s LC-MS výsledky a rozšíření referenčních databází. Využití pokročilých algoritmů a umělé inteligence pro automatizovanou anotaci neznámých sloučenin slibuje další vylepšení.

Závěr

GC-APCI spojené s vysokým rozlišením TOF-MS představuje výrazný pokrok v identifikaci a strukturální elucidaci metabolitů, které nelze detekovat klasickou EI metodou. Metoda poskytuje robustní platformu pro detailní metabolomické studie a odhalování nových biomarkerů.

Reference

1. [1] Bruker Daltonics; Technical Note #TN-23: Certainty in Small Molecule Identification by Applying SmartFormula3D on a UHR-TOF Mass Spectrometer
2. [2] J. Plassmeier, A. Barsch, M. Persicke, K. Niehaus, J. Kalinowski; J. Biotechnol. 130 (2007) 354-363