Quantitative Analysis of Stable Isotopes of Glucose in Blood Plasma Using Quadrupole GC-MS

Význam tématu

Studium dynamiky glukózy v živých organismech je klíčové pro porozumění metabolickým cestám, jako jsou glykolýza a glukoneogeneze, a pro výzkum onemocnění, například diabetu. Kvantitativní analýza stabilně značené glukózy v krvi a tkáních umožňuje sledovat metabolické toky a zjišťovat poruchy energetického metabolismu na mikroúrovni.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo porovnat vliv tří derivatizačních postupů – trifluoroacetylace, methoxim-trimethylsilylace a aldonitril-pentaacetylace – na kvantitativní stanovení D-glukózy-13C6 v krevní plazmě pomocí kvadrupólového GC-MS. Studie se zaměřila na selektivitu, počet derivátů, vliv přirozených izotopů glukózy a dosažitelnou detekční hranici.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků se používaly standardy D-glukózy a D-glukózy-13C6 v roztocích 1–10 µg/mL. Derivatizace probíhala třemi způsoby:

• Trifluoroacetylace s MBTFA v pyridinu při 60 °C po 60 min;
• Methoximace (methoxyamin HCl v pyridinu, 30 °C, 90 min) následovaná trimethylsilylací (MSTFA, 37 °C, 30 min);
• Aldonitril-pentaacetylace: nitrilace hydroxylaminochloridem (90 °C, 40 min) a acetylace acetic anhydridem (90 °C, 60 min), následné sušení a redissoluce v ethylacetátu.

Analýzy se prováděly na GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu) s kolonou Rtx-5MS (30 m × 0,25 mm, df 0,25 µm), split/splitless injektorem AOC-20i + s a softwarem GCMSsolution. Podmínky GC: teplotní program 80 °C (2 min) → 320 °C (15 °C/min, 6 min), nosný plyn He, LINV 36,8 cm/s. MS režim SIM, m/z 191, 319 nebo odpovídající fragmenty.

Použitá instrumentace

• GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu)
• Auto-injector AOC-20i + s
• Kolona Rtx-5MS
• Software GCMSsolution
• Databáze GC/MS Metabolites Spectral Database (retention indices + spektrogramy)

Hlavní výsledky a diskuse

Trifluoroacetylace vedla k čtyřem derivátům (alfa/beta pyranosy a furanosy), což zhoršilo citlivost a složitost analýzy. Methoxime-TMS přineslo dva izomery syn/anti, fragmenty obsahovaly Si s vysokým přirozeným izotopovým příspěvkem (~0,69 % → ~6,4 µg/mL), a navíc docházelo k přetížení kolony vysokou koncentrací endogenní glukózy. Aldonitril-pentaacetylace vyústila v jediný derivát, fragmenty s pěti uhlíky bez Si téměř eliminovaly vliv přirozených izotopů (0,00237 % → ~0,02 µg/mL). Split 15:1 zajistil optimální tvar a citlivost. V slepém vzorku se detekovalo 0,022 µg/mL, v přidaném 1,019 µg/mL D-glukózy-13C6.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda aldonitril-pentaacetylace umožňuje spolehlivou kvantifikaci stabilně značené glukózy na úrovni jednotek ng/mL i v přítomnosti vysoké hladiny endogenního analytu. Jednoduchá tvorba jednoho derivátu zjednodušuje zpracování dat a minimalizuje interferenci izotopů. Aplikuje se ve výzkumu metabolismu, farmakokinetice a diagnostice cukrovky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření derivatizačních protokolů na další metabolity a lipidy.
• Integrace s LC-MS, zrychlení a automatizace přípravy vzorků.
• Využití pokročilých knihoven s retenčními indexy pro lepší identifikaci neznámých složek.
• Implementace vysokopropustných metabolomických platforem pro klinickou a průmyslovou praxi.

Závěr

Aldonitril-pentaacetylace se ukázala jako optimální derivatizační metoda pro kvantitativní analýzu D-glukózy-13C6 v krevní plazmě pomocí kvadrupólového GC-MS. Nabízí jeden stabilní derivát, minimální vliv přirozených izotopů a dostatečnou citlivost pro mikroúrovňové stanovení.

Reference

1. Capillary Gas Chromatography. Edited by the GC Research Council of the Japan Society for Analytical Chemistry.
2. Matsuhisa M, Yamasaki Y, Shiba Y, Nakahara I, Kuroda A, Tomita T. Important Role of the Hepatic Vagus Nerve in Glucose Uptake and Production by the Liver. Metabolism. 2000;49(1):11–16.
3. Pongsuwan W, Fukusaki E, Bamba T, Yonetani T, Yamahara T, Kobayashi A. Prediction of Japanese Green Tea Ranking by Gas Chromatography/Mass Spectrometry-Based Hydrophilic Metabolite Fingerprinting. J Agric Food Chem. 2007;55:231–236.
4. Hannestad U, Lundblad A. Accurate and Precise Isotope Dilution Mass Spectrometry Method for Determining Glucose in Whole Blood. Clin Chem. 1997;43(5):794–800.