13C-Metabolic Flux Analysis of Central Carbon Metabolism Using GC-MS

Význam tématu

Metoda 13C-metabolické fluxové analýzy (13C-MFA) nabízí přímý pohled na tok uhlíku v buňce a umožňuje kvantifikovat rychlosti jednotlivých reakcí v centrálním metabolismu. Tyto informace jsou klíčové při optimalizaci bakteriálních produktivních kmenů, při odhalování abnormalit v metabolismu lidských buněk (např. v onkologii) a v hodnocení účinku farmak na metabolické dráhy.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané práce bylo demonstrovat kompletní postup 13C-MFA centrálního metabolismu Escherichia coli pomocí kombinace značené kultivace, analýzy peptidogenních aminokyselin technikou GC-MS, analýzy metabolitů média pomocí HPLC a výpočetní integrace dat v softwaru OpenMebius. Studie ukazuje, jak určit větvení toku mezi glykolýzou a pentózovým fosfátovým cyklem, směr toku v cyklu TCA a neaktivní větve, např. glyoxylátové rozvětvení či Entner–Doudoroffovu dráhu.

Použitá metodika

Pro značenou kultivaci byly použity směsi [1-13C] a [U-13C] glukózy v M9 médiu. Buňky v logaritmické fázi byly odebrány, promyty fyziologickým roztokem a lyzovány kyselinovou hydrolýzou. Po vakuové sušení následovalo derivatizační ošetření MTBSTFA+TBDMCS. Deriváty proteinogenních aminokyselin byly analýzou GC-MS (SIM režim) kvantifikovány v jednotlivých izotopových frakcích. Současně byly časové profily substrátu (glukóza) a produktu (acetát) získány HPLC s RID detektorem. Získaná spektrometrická data (M, M+1, M+2 …) a metabolitické toky z média se vložily do OpenMebius, kde byl odfiltrován vliv přírodních izotopů a optimalizována matice stoichiometrických rovnic pro odhad metabolického toku.

Použitá instrumentace

• GC-MS/MS Shimadzu GCMS-TQ8040 s autoinjektorem AOC-20i
• Kolona DB-5MS+DG, SIM režim (471 kanálů pro 15 aminokyselin)
• HPLC Shimadzu Prominence s RID-20A detektorem a kolonou Aminex HPX-87H
• Termostatická jednotka TU-1C a vakuový odparovač
• Softwarové řešení OpenMebius pro 13C-MFA

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza toku centrálního metabolismu E. coli odhalila, že z celkové rychlosti uptake glukózy (normalizováno na 100) prochází 75 % glykolýzou a 23 % pentózovým fosfátovým cyklem. Oxidativní větev TCA cyklu vykazuje vyšší aktivitu, zatímco glyoxylátový cyklus i Entner–Doudoroffova dráha byly detekovány jako neaktivní. Výsledky potvrzují, že 13C-MFA dokáže rozlišit větvení reakcí a odhadnout směr a poměr průtoku uhlíku s vysokou přesností.

Přínosy a praktické využití metody

• Optimalizace mikrobiálních kmenů pro bioprodukci: cílené zvyšování toku do požadovaných produktů.
• Biomedicínský výzkum: diagnostika a sledování metabolických změn u nemocných buněk (např. nádorových).
• Farmakologie: hodnocení vlivu léčiv na buněčný metabolismus.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření 13C-MFA do vícekomponentních systémů, integrace s metabolomikou a proteomikou pro komplexnější pohled na regulaci metabolismu. Dále se rozvíjí software pro rychlejší zpracování izotopových dat a modelování dynamických průběhů (IST-MFA). Kombinace s AI nástroji by mohla přinést automatizovanou optimalizaci buněčných tovární.

Závěr

Studie demonstrovala robustní a reprodukovatelnou metodiku 13C-MFA centrálního metabolismu E. coli s využitím GC-MS a HPLC. Integrovaný přístup dovoluje detailní mapování toků uhlíku a identifikaci neaktivních či aktivovaných větví, což má široké využití v biotechnologii, medicíně i farmacii.

Reference

1. Metallo C. M. et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 481(7381), 380–384 (2012).
2. Okahashi N. et al. Metabolic characterization of cultured mammalian cells by mass balance analysis, tracer labeling experiments and computer-aided simulations. J. Biosci. Bioeng. 120(6), 725–731 (2015).
3. Toya Y., Shimizu H. Flux analysis and metabolomics for systematic metabolic engineering of microorganisms. Biotechnol. Adv. 31(6), 818–826 (2013).
4. Kajihata S. et al. OpenMebius: An Open Source Software for Isotopically Nonstationary 13C-Based Metabolic Flux Analysis. BioMed Res. Int. 2014, 627014 (2014).
5. Zamboni N. et al. 13C-based metabolic flux analysis. Nat. Protoc. 4(6), 878–892 (2009).