Deciphering Phosphorothioate Isomerism in Synthetic Oligonucleotides Using the Unique Geometry of the Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer

Deciphering Phosphorothioate Isomerism v syntetických oligonukleotidech: shrnutí aplikace s využitím Cyclic IMS P20

Význam tématu
Oligonukleotidové terapeutika získala zásadní význam v léčbě řady genetických a vrozených chorob. Častou chemickou modifikací používanou ke zvýšení stability a biologické účinnosti je náhrada jednoho nebridžujícího kyslíku sírou na fosfátu – tzv. phosphorothioate (PS) linker. Tato modifikace vytváří chirální centrum u fosforu (Rp/Sp), což vede ke vzniku diastereomerů; jejich relativní zastoupení může ovlivnit farmakodynamiku, farmakokinetiku a celkovou účinnost léčiva. S rostoucí regulací oligonukleotidů je proto důležité vyvinout analytické metody umožňující lokální charakterizaci stereochemie PS linek pro vývoj, kontrolu kvality a regulatorní dokumentaci.
Cíle a přehled studie / článku
Cílem aplikace bylo demonstrovat novou analytickou strategii pro lokalizované stanovení Rp/Sp poměrů jednotlivých PS linkerů v oligonukleotidech. Metoda využívá generování interních dimerických fragmentů (dva nukleotidy spojené jedním PS) následované vysoce rozlišovacím multipass Cyclic ion mobility (IMS) rozlišením, které odděluje diastereomery podle jejich odlišné mobility. Práce byla ilustrována na 16nt antisense oligonukleotidovém standardu (LCASO) a ukazuje přístup, který lze rozšířit na ASO, siRNA a sgRNA.
Použitá metodika a instrumentace

• Strategie: MS/MS fragmentace intactního oligonukleotidu v trap collision cell za účelem generování interních fragmentů; selekce dimerů (obsahujících jediný PS linker) a následné oddělení Rp/Sp pomocí multipass Cyclic IMS.
• Postupy pro rozlišení izomerických dimerů: (i) in-source CID (zvýšené napětí na kuželu) → selekce prvostupňového fragmentu kvadrupolem → druhostupňové CID → IMS separace dimeru; (ii) MS/MS v trap → IMSn slicing pro odstranění interferencí → opakovaná disociace uvnitř Cyclic IMS → IMS separace cílového dimeru.
• Instrumentace: Waters Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer; MassLynx software pro vyhodnocení oblastí plošných signálů v profilech arrival time distribution (ATD). Uvedený standard: Waters Lipid Conjugated Antisense Oligonucleotide (LCASO, p/n 186010747).
• Ionizační a separační režimy: přímá infúze po odsolení (možnost LC-návaznosti), kvadrupólová izolace nakrmitelných nabitých stavů, kolize v trap collision cell, in-source CID, IMSn slicing a multipass Cyclic ion mobility pro zvýšení rozlišení.

Hlavní výsledky a diskuse

• Generování interních dimerů umožnilo izolovat fragmenty obsahující jediné PS centrum, čímž se výrazně snížila komplexita izomerů (2n → 2) pro daný fragment a umožnila lokální analýza stereochemie.
• Multipass Cyclic IMS efektivně oddělilo Rp a Sp diastereomery dimerických fragmentů podle rozdílů v driftových časech; rozlišení a kvantifikace byly provedeny integrací plošných hodnot ATD signálů v MassLynx.
• Příkladné kvantifikace z LCASO: pro dimer odpovídající linkeru 6 byla určena Rp:Sp poměr 48:52 (metoda in-source CID→MS/MS→IMS), pro dimer odpovídající linkeru 10 byl určen poměr ~40:60 prostřednictvím MS/MS + IMSn slicing. Tyto výsledky ilustrují schopnost rozlišit i izomerické dimerické motify se shodným m/z.
• Význam jedinečné geometrie Cyclic IMS P20 spočívá v provedení MS/MS fragmentace a selekce před vstupem do IMS; tím lze zajistit, že pouze cílové fragmenty (nebo eliminovaná interferenční složka) vstoupí do vysokorozlišovacího multipass IMS, což je klíčové pro lokalizaci PS linkerů v sekvenci.
• Omezení: absolutní přiřazení mobility-peaků k Rp nebo Sp konfiguracím vyžaduje stereopuristické standardy nebo podpůrné výpočty (computational modelling). Výsledky tedy poskytují relativní poměry diastereomerů, nikoli definitivní stereochemické přiřazení bez dalších dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost měřit lokální stereochemii jednotlivých PS linkerů v oligonukleotidech, což pomáhá korelovat stereochemii s biologickou aktivitou a stabilitou.
• Užitečné v raném vývoji, optimalizaci chemie a v procesním vývoji (sledování šaržovosti, kontrola výrobního procesu), stejně jako v podpoře pozdějších fází klinického vývoje vzhledem k rostoucím regulatorním požadavkům.
• Metoda je kompatibilní s různými třídami terapeutických oligonukleotidů (ASO, siRNA, sgRNA) a lze ji nasadit buď jako off-line přímá infúze, nebo v kombinaci s chromatografickou separací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace stereopuristických standardů nebo rozsáhlejších výpočetních studií pro definitivní přiřazení Rp/Sp signálů a rozvoj databází mobility hodnot pro standardní motify.
• Automatizace workflow a propojení s LC separacemi pro vyšší throughput a kompatibilitu s rutinami QC v průmyslových podmínkách.
• Rozšíření na komplexní produktové formy včetně konjugovaných a plně přefosforothioátovaných 20-měrů, kde lokální stereochemie může zásadně ovlivnit farmakologii.
• Možné využití IMSn strategií a víceúrovňových MSn protokolů pro detailnější mapování izomerických a sekvenčních interferencí v těžce modifikovaných oligonukleotidech.

Závěr
Použití před-IMS fragmentace v kombinaci s vysokorozlišovacím multipass Cyclic IMS na systému Cyclic IMS P20 poskytuje účinný, lokalizovaný přístup ke kvantifikaci phosphorothioate diastereomerů na úrovni jednotlivých linkerů. Metoda snižuje komplexitu analyty pomocí interních dimerů, řeší izomerické interferencí prostřednictvím dvou přístupů (in-source CID + MS/MS nebo MS/MS + IMSn slicing) a umožňuje získat reprodukovatelné poměry Rp:Sp, které mohou podpořit vývoj, optimalizaci a kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv. Pro definitivní stereochemické přiřazení je vhodné doplnit měření stereopuristickými standardy nebo modelováním.
Reference

1. Byrne M. et al. Stereochemistry Enhances Potency, Efficacy, and Durability of Malat1 Antisense Oligonucleotides In Vitro and In Vivo in Multiple Species. Trans Vis Sci Tech. 2021;10(1):23.
2. Liu W. et al. Impact of Stereopure Chimeric Backbone Chemistries on the Potency and Durability of Gene Silencing by RNA Interference. Nucleic Acids Res. 2023;51(9):4126–4147.
3. European Medicines Agency. Development and manufacture of Oligonucleotides. EMA/CHMP/CVMP/QWP/262313/2024.
4. FDA. Draft Guidance on Nusinersen Sodium. February 2022.
5. Bill MK. et al. Separation of PS Diastereomers in GalNAc-conjugated siRNA—A Comparative Study of Chromatographic and Ion Mobility Mass Spectrometry Approaches. Anal Bioanal Chem. 2025;417:6313–6325.
6. Lardeux H. et al. Unravelling the Link Between Oligonucleotide Structure and Diastereomer Separation in Hydrophilic Interaction Chromatography. Anal Chem. 2024;96(24):9994–10002.
7. Togawa H. et al. Separation of the Diastereomers of Phosphorothioated siRNAs by Anion-exchange Chromatography Under Non-denaturing Conditions. J Chromatogr A. 2024;1721:464847.
8. Mir B. et al. NMR Characterization of the Diastereomeric Composition of a Model Therapeutic Oligonucleotide. J Pharm Sci. 2025;114(8):103861.
9. Sharon EM. et al. Diastereomer Characterization of PS-Modified Synthetic Oligonucleotides Using Cyclic IMS-MS. Anal Chem. 2024;96(38):15304–15312.