Deep Characterization of Aspartic Acid Isomerism Using High-Resolution Cyclic™ Ion Mobility and Electron-Capture Dissociation

Hloubková charakterizace izomerismu asparagové kyseliny pomocí vysoce rozlišené cyklické iontové mobility a zachycování elektronů

Význam tématu

Asparagová kyselina (Asp) může v bioterapeutických proteinech isomerizovat do čtyř forem (L-Asp, D-Asp, L-isoAsp, D-isoAsp), které mohou ovlivnit bezpečnost a účinnost léčiv. Přesné rozlišení těchto izomerů je klíčové pro monitoring kvality a stability proteinových terapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ukázat, že kombinace vysokého rozlišení cyklické iontové mobility (Cyclic IMS) a zachycování elektronů (ECD) umožňuje kompletní separaci a jednoznačnou identifikaci všech čtyř Asp izomerů v tryptických peptidech monoklonálních protilátek, i když jsou přítomny v nízké koncentraci.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický workflow zahrnoval:

• Kapalinovou chromatografii spojenou s cyklickou iontovou mobilitou (LC-Cyclic IMS-MS) s desetipruhovou multipass separací pro vysoké rozlišení izomerů
• Fragmentaci zachycením elektronů (ECD) v post-IMS konfiguraci k produkci diagnostických iontů c(n-1)+57 Da a z(m-n-1)-57 Da

Hlavním zařízením byl SELECT SERIES™ Cyclic IMS Mass Spectrometer vybavený buňkou pro ECD.

Hlavní výsledky a diskuse

Standardní LC-MS poskytla pouze částečné rozlišení Asp a isoAsp izomerů. Nasazení 10průchodové cyklické IMS vedlo k úplné separaci všech čtyř forem na 2D mapě retenčního času vs. arrival time. Následná ECD fragmentace odhalila charakteristické ionty, které jednoznačně odlišily isoAsp od Asp variant, a potvrdila přiřazení nízkomobilních signálů k L-isoAsp a D-isoAsp.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní rozlišení Asp a isoAsp izomerů bez potřeby dlouhých chromatografických gradientů
• Zrychlené workflow díky vysokému rozlišení IMS separace
• Snížení nákladů na vývoj díky menší závislosti na syntetických standardech

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití cyklické IMS a ECD k analýze dalších typů izomerismu a posttranslačních modifikací v proteinových terapeutikách. Dále je možné integrovat pokročilé softwarové platformy pro automatizovanou analýzu a kvantifikaci kritických kvalitativních atributů.

Závěr

Kombinace vysoce rozlišené cyklické iontové mobility a elektron-capture dissociation představuje pokročilou analytickou platformu pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci Asp izomerů v komplexních bioterapeutických vzorcích, zrychluje workflow a zvyšuje jistotu charakterizace kritických kvalitativních parametrů.

Reference

1. Lambeth TR, Riggs DL, Talbert LE, Tang J, Coburn E, Kang AS a kol. Spontaneous Isomerization of Long-Lived Proteins Provides a Molecular Mechanism for the Lysosomal Failure Observed in Alzheimer’s Disease. ACS Cent Sci. 2019;5(8):1387–1395.
2. Fujii N, Sakaue H, Sasaki H, Fujii N. A rapid, comprehensive liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based survey of the Asp isomers in crystallins from human cataract lenses. J Biol Chem. 2012;287(47):39992–40002.
3. Eakin CM, Miller A, Kerr J, Kung J, Wallace A. Assessing analytical methods to monitor isoAsp formation in monoclonal antibodies. Front Pharmacol. 2014;5:87.
4. Nytka M, Wan J, Tureček F, Lemr K. Cyclic Ion Mobility of Isomeric New Psychoactive Substances Employing Characteristic Arrival Time Distribution Profiles and Adduct Separation. J Am Soc Mass Spectrom. 2024;35(8):1733–42.
5. Colson E, Decroo C, Cooper-Shepherd D, Caulier G, Henoumont C, Laurent S a kol. Discrimination of Regioisomeric and Stereoisomeric Saponins from Aesculus hippocastanum Seeds by Ion Mobility Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2019;30(11):2228–37.
6. Wisanpitayakorn P, Jariyasopit N, Duangkumpha K, Goh JX, Palmer ME, Sirivatanauksorn Y a kol. Multi-Pass Arrival Time Correction in Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry for Imaging and Shotgun Lipidomics. ACS Meas Sci Au. 2025;5(1):109–19.
7. Berthias F, Cooper-Shepherd DA, Holck FHV, Langridge JI, Jensen ON. Full Separation and Sequencing of Isomeric Proteoforms in the Middle-Down Mass Range Using Cyclic Ion Mobility and Electron Capture Dissociation. Anal Chem. 2023;95(29):11141–8.
8. Su Y, Zhao B, Zhang L, Shen B, Guo C, Xiao H a kol. Quantitative Analysis of Phosphorothioate Isomers in CRISPR sgRNA at Single-Residue Resolution Using Endonuclease Digestion Coupled with Liquid Chromatography Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry (LC/cIMS). Anal Chem. 2025;97(4):2223–31.
9. Cournoyer JJ, Pittman JL, Ivleva VB, Fallows E, Waskell L, Costello CE a kol. Deamidation: Differentiation of aspartyl from isoaspartyl products in peptides by electron capture dissociation. Protein Science. 2005;14(2):452–63.
10. Kjeldsen F, Haselmann KF, Budnik BA, Jensen F, Zubarev RA. Dissociative capture of hot (3–13 eV) electrons by polypeptide polycations: an efficient process accompanied by secondary fragmentation. Chem Phys Lett. 2002;356(3):201–6.
11. Cooper-Shepherd D. Comprehensive Biotherapeutic Characterization Enabled by Electron Capture Dissociation on the SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS Mass Spectrometer. Waters Application Note. 2025;720008287.