Low-input label-free proteomics using the Orbitrap Astral MS and μPAC Neo Plus Columns

Význam tématu

Analýza nízkoobjemových a nízko-hmotnostních proteomických vzorků je klíčová pro studium buněčných populací s omezeným materiálem (např. single-cell, mikrodisekce). Label-free kvantifikace založená na data-independent acquisition (DIA) nabízí výhodu nižšího počtu chybějících hodnot a lepší reprodukovatelnosti než DDA, což je zásadní pro citlivé, nízkokoncentrované vzorky. Kombinace vysoce citlivého hmotnostního analyzátoru (Orbitrap Astral) s vysoce efektivní nanoflow chromatografií (μPAC Neo Plus) a volitelným FAIMS frakcionováním zvyšuje citlivost a proteomické pokrytí z minimálních vstupních množství, čímž rozšiřuje možnosti aplikací v biologii a medicíně.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ilustrovat schopnost identifikace peptidů a proteinů a kvantifikační přesnost při nízkém vstupním množství (50 pg–20 ng HeLa digestu) pomocí DIA na Orbitrap Astral MS ve spojení s μPAC Neo Plus 50 cm kolony. Studie porovnávala různé průchodnosti (20–100 samples per day, SPD), režimy FAIMS (1 vs. 2 CV), direct-injection vs. trap-and-elute workflow a optimalizovala DIA izolace a maximální injekční časy podle nálože vzorku. Data zpracováno v Spectronaut (directDIA+) s 1% FDR, vše v triplikátu pro každou podmínku.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral Mass Spectrometer (s vysokodynamickým HDR detektorem)
• FAIMS Pro Duo Interface
• Vanquish Neo UHPLC System
• μPAC Neo Plus 50 cm HPLC Column (75 µm i.d.) a volitelná μPAC Trapping Column (300 µm, 1 cm)
• Thermo Scientific EASY-Spray zdroj a EASY-Spray emitér 10 µm I.D.
• Sonation column oven pro μPAC kolony
• Software: Spectronaut 21.1 (directDIA+), Proteome Discoverer, DIA-NN jako doplňkové nástroje

Použitá metodika

• Vzorek: Pierce HeLa Protein Digest Standard, rekonstituovaný v 0,02% DDM/0,1% FA; seriální ředění 50 pg–20 ng; triplikáty.
• Chromatografie: μPAC Neo Plus 50 cm kolona při 50 °C; režimy direct-injection a trap-and-elute (backward flush) testovány při průchodnostech 20–100 SPD.
• DIA akvizice: load-dependent nastavení (širší izolační okna a delší injekční časy pro nízké nálože, užší okna a kratší doby pro vyšší nálože). Příklady: 50 pg – 30 m/z okno, 80 ms; 250 pg – 20 m/z, 40 ms; 20 ng – 3 m/z, 7 ms.
• FAIMS: testováno 1 CV (-50 V) a 2 CVs (-58 V, -44 V) pro zlepšení selektivity a snížení pozadí.
• Data processing: Spectronaut directDIA+ s 1% FDR proti Human canonical FASTA (~20 428 záznamů); MS1 kvantifikace pro 50 pg–1 ng, MS2 pro ≥2.5 ng.

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost a pokrytí: Při 250 pg HeLa digestu a 50 SPD metoda překročila >55 000 peptidů a >6 900 proteinových skupin. Nejvyšší počet identifikací u 250 pg byl dosažen při 30–40 SPD (>53 600 peptidů a >6 800 proteinů).
• Load-dependent optimalizace DIA: Úprava izolačních oken a injekčních časů podle nálože umožnila lineární chování napříč širokým rozsahem vzorků a lepší využití dynamického rozsahu Astral analyzátoru než fixní parametry.
• FAIMS efekt: Použití dvou FAIMS CV s delšími gradenty zvýšilo počet peptidových identifikací v průměru o ~33% a počet proteinových skupin o ~4%, díky redukci pozadí a plynové frakcionaci.
• Průchodnost vs. hloubka: Testy 20–100 SPD ukázaly, že existuje kompromis mezi rychlostí a počtem identifikací; pro 250 pg byl optimální rozsah 30–40 SPD. Přesto i vyšší průchodnosti (až 100 SPD) poskytovaly solidní identifikace a kvantifikační výkon.
• Reprodukovatelnost: Opakované experimenty o 50 hodin později prokázaly stabilitu workflow — variace identifikací v mezích ±10% pro peptidy a ±5% pro proteiny. Medián CV pro proteinové skupiny se pohyboval mezi 5,0% a 6,9% napříč SPD hodnotami.
• Trap-and-elute vs. direct injection: Trap-and-elute umožnil rychlé načítání a desalting větších objemů (<3 min) a byl vhodný pro single-cell typy, i když s mírným rozšířením šířky píků. Zvýšení injekčního objemu na 7.5 µL vedlo ke ~5% snížení peptidových identifikací a ~2% snížení proteinových identifikací, což bylo připsáno adsorpčním ztrátám při nízké koncentraci. Použití 0.1% TFA při načítání snížilo identifikace o 4–6% (pravděpodobné ion-suppression), avšak vedlo k až 8% zúžení průměrné základní šířky píků u některých podmínek.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow kombinuje vysokou citlivost Orbitrap Astral s velmi úzkými a opakovatelnými separacemi μPAC, což umožňuje hluboké proteomické pokrytí i z pikogramových vzorků.
• Load-adaptivní DIA parametry a FAIMS umožňují optimalizaci pro různé typy experimentů (single-cell, malá populační množství, vysokoprostupné srovnávací studie).
• Trap-and-elute režim zvyšuje flexibilitu pro vzorky s nízkou koncentrací a větším objemem a snižuje riziko ucpání nano-flow systémů, což je praktické pro rutinní nasazení v laboratořích.
• Metoda poskytuje robustní kvantifikaci (medián CV proteinů ~5–7%), vhodnou pro biologické srovnávací studie a objevování biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace více CV v FAIMS a jemná optimalizace gradentu mohou dále zvýšit proteomické pokrytí u extrémně nízkých náložích.
• Pokročilé algoritmy zpracování DIA dat (včetně deep-learning přístupů) mohou zlepšit dekonvoluci složitých spekter z nanoflow/DIA kombinací a zvýšit citlivost při nízkých hladinách.
• Rozšíření aplikací na skutečnou single-cell proteomiku, analýzu mikrodisekcí tkání nebo klinické minimum-sample studie s validací biomarkerů.
• Automatizace trap-and-elute a optimalizované vzorkovací postupy (snižování adsorpce) povedou k lepším výtěžkům u velmi ředěných vzorků.

Závěr

Popsaný workflow (Orbitrap Astral MS + μPAC Neo Plus 50 cm + FAIMS) dokáže při nízkém vstupu (piko–nanogramy) dosáhnout hlubokého proteomického pokrytí a konzistentní kvantifikace. Load-dependent DIA parametry a volba FAIMS konfigurace jsou klíčové pro vyvážení citlivosti a selektivity. Trap-and-elute varianty rozšiřují praktickou použitelnost pro nízkokoncentrované a single-cell typy vzorků, přičemž zachovávají vysoký počet identifikací s dobrou reprodukovatelností.

Reference

1. Hebert AS, Prasad S, Belford MW, Bailey DJ, McAlister GC, Abbatiello SE, Huguet R, Wouters ER, Dunyach J-J, Brademan DR, Westphall MS, Coon JJ. Comprehensive single-shot proteomics with FAIMS on a hybrid Orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 2018;90(15):9529–9537.
2. Thermo Scientific. μPAC Neo Plus HPLC columns: Use and care instructions (Instruction Sheet DOC018). Thermo Fisher Scientific; 2025.
3. Arrey TN, Pashkova A, Delanghe B, Jansons M, Damoc E. Enhanced sensitivity of the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for deeper proteome coverage in single-cell proteomics applications (Technical Note TN004019). Thermo Fisher Scientific; 2025.