Deeper proteome coverage and faster throughput for low input samples on the Thermo Scientific Orbitrap Astral mass spectrometer

Význam tématu

Analýza proteomů z velmi malých vstupních množství, včetně jednotlivých buněk, je klíčová pro porozumění heterogenitě biologických systémů. Moderní hmotnostní spektrometrie umožňuje získat hluboké proteomické pokrytí i z pikogramových vzorků, čímž otevírá nové možnosti ve výzkumu jediné buňky, biomarkerů a pokročilé QA/QC analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit citlivost, pokrytí proteomu a výkonnost zpracování nízkých vstupních množství standardu Pierce HeLa protein digest na hmotnostním spektrometru Thermo Scientific Orbitrap Astral. Studie porovnávala přístupy data-independent acquisition (DIA) bez knihovny (directDIA) a s projektově specifickou spectral knihovnou.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky standardu HeLa digest byly naředěny na koncentrace od 50 pg po 10 ng a separovány na UHPLC systému Vanquish Neo (flow 0,2 µL/min) s kolónou µPAC Neo Low Load 50 cm. Vzorky prošly FAIMS Pro rozhraním pro potlačení pozadí, dále byly analyzovány Orbitrap Astral MS se synchronizovanými plnými Orbitrap skeny (MS1) a rychlými vysokorychlostními Astral MS2 skeny.

• UHPLC: Vanquish Neo Pump/Autosampler, kolóna µPAC Neo Low Load 50 cm
• Ionizace: EasySpray ion source, FAIMS Pro
• Hmotnostní spektrometr: Orbitrap Astral s Orbitrap analyzátorem (MS1) a Astral analyzátorem (MS2)
• Software: Spectronaut 17 s directDIA a projektově specifickou spectral knihovnou

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace parametrů DIA izolace ukázala, že okno 20 m/z poskytuje nejlepší poměr počtu identifikovaných proteinů (~4 000 u 250 pg) a peptidů. Pro nízké množství vzorku byly ideální injekční časy MS2 40–50 ms. S optimalizovaným protokolem (80 vzorků/den) dosáhly identifikace:

• 50 pg: ~2 600 proteinů, ~10 900 peptidů
• 250 pg: ~4 000 proteinů, ~19 000 peptidů
• 10 ng: ~6 600 proteinů, ~47 000 peptidů

Projektově specifická knihovna z dílčích množství ≥2,5 ng vedla k >5 500 proteinům u 250 pg vzorku. Kvantitativní opakovatelnost byla vynikající: medián CV proteinových abundancí 11,9 % u 250 pg a 8,9 % u 10 ng.

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinace Orbitrap Astral hmotnostního spektrometru, UHPLC Vanquish Neo a FAIMS Pro rozhraní poskytuje:

• Vysokou citlivost a hluboké pokrytí proteomu z nízkých vstupních množství
• Rychlý režim 80 vzorků za den při zachování kvality dat
• Spolehlivou kvantitativní přesnost a preciznost pro biomarkerové studie a QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj single-cell proteomiky s vyšší propustností a citlivostí. Integrace strojového učení pro in silico knihovny, rozšíření aplikací na modifikace proteinů (PTM) a nasazení v klinických vysokopropustných laboratořích jsou perspektivní směry.

Závěr

Orbitrap Astral mass spectrometer v kombinaci s Vanquish Neo UHPLC a FAIMS Pro umožňuje robustní, rychlé a vysoce citlivé analýzy proteomů z velmi nízkých vstupních množství. Metoda poskytuje nadstandardní proteomické pokrytí a kvantitativní preciznost vhodnou pro single-cell studie a průmyslové aplikace.