Increased sensitivity for low-input label-free proteomics using the Orbitrap Astral MS and μPAC Neo Plus Columns

Význam tématu

Analýza nízkonákladových (low-input) proteomických vzorků je klíčová pro studium omezených biologických materiálů, včetně jednotlivých buněk a malých klinických odběrů. Zvýšení citlivosti, kvantifikační přesnosti a pokrytí proteomu bez nutnosti značení umožňuje širší aplikace v biologickém výzkumu, biomedicíně a kvalitativní kontrole. Kombinace vysoce citlivého hmotnostního spektrometru Orbitrap Astral s inovativní nanoflow chromatografií na mikro-pillar array (μPAC Neo Plus) slibuje zásadní zlepšení detekce nízkoabundantních peptidů a robustnosti pracovního postupu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo ukázat identifikaci peptidů a proteinů a přesnost jejich měření při nízkých vstupech vzorku pomocí label-free data-independent acquisition (DIA) na Orbitrap Astral MS v kombinaci se systémem Vanquish Neo UHPLC a μPAC Neo Plus 50 cm kolonkou. Studie porovnává výkon μPAC Neo Plus s klasickou 75 μm × 25 cm pulled-tip kolonou napříč rozsahem naložení (50 pg–20 ng HeLa digestu), hodnotí vliv FAIMS, optimalizaci DIA parametrů podle zatížení a porovnává direct-injection a trap-and-elute režimy.

Použitá metodika a instrumentace

Obecný přístup:

• Label-free kvantifikace pomocí DIA; data zpracována v Spectronaut 19.9 (1% FDR).
• Diluační řada HeLa digestu 50 pg–20 ng, tří repliky pro každou koncentraci.
• Optimalizace DIA parametrů (šířka izolačních oken a maximální injekční časy) v závislosti na množství vzorku.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Orbitrap Astral Mass Spectrometer (Astral + Orbitrap hybrid)
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System
• Thermo Scientific μPAC Neo Plus 50 cm HPLC Column a μPAC Trapping Column (pro trap-and-elute)
• Thermo Scientific FAIMS Pro Duo Interface (gas-phase fractionation a potlačení pozadí)
• Thermo Scientific EASY-Spray zdroj a EASY-Spray emitter (10 μm I.D.)
• Column oven (Sonation PRSO‑V2‑PF) pro řízení teploty μPAC kolon
• Spectronaut 19.9 pro DIA analýzu; doplňkově Proteome Discoverer a DIA‑NN jsou zmiňovány

Klíčové experimentální parametry:

• Metody s různým throughput: 20–100 sample per day (SPD); 1 nebo 2 FAIMS CV (-50 V, případně -58 V a -44 V).
• DIA okna a maximální injekční časy nastavovány podle zatížení (např. pro 50 pg použito 30 m/z a IT 80 ms; pro 20 ng použit 3 m/z a IT 7 ms).
• Kolonka μPAC: 75 μm I.D., 50 cm délka, provozní teplota 50 °C, max. tlak 450 bar.

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a identifikace:

• μPAC Neo Plus 50 cm překonala 75 μm × 25 cm packed-bed kolonku zejména při nízkých vstupech (<5 ng) s nárůstem identifikací peptidů 6–33% a až 35% navýšením peptidů s CV <20% při nízkých množstvích.
• Ve středních až vysokých vstupech (>2.5 ng) byl rozdíl mezi kolonami menší (<6%).

Vliv FAIMS:

• FAIMS s odstraněním singletních pozadových iontů a gas-phase fractionation redukuje spektrální komplexitu a zvyšuje citlivost.
• Použití dvou FAIMS CV (dlouhé gradienty) zvýšilo počet peptidových identifikací v průměru o ~37 % a počet identifikovaných proteinových skupin o ~5 % oproti jedné CV.

Optimalizace Astral DIA parametrů:

• Load-dependent volba šířky okna a injekčního času zajistila lepší využití dynamického rozsahu Astral analyzátoru, čímž byla zachována linearita detekce napříč 50 pg–20 ng.

Throughput a reprodukovatelnost:

• Analýzy 250 pg HeLa napříč 20–100 SPD ukázaly, že optimální identifikace se dosahují při 30–50 SPD (nad 49 000 peptidů a přes 6 300 proteinových skupin při daných podmínkách).
• Proteinové CV mediány se pohybovaly mezi ~13.5 % až 15 %, tedy konzistentní kvantifikační výkon i při vyšších rychlostech.

Trap-and-elute vs direct injection:

• Trap-and-elute umožnil rychlé naložení a odsolení větších objemů během ~3 minut; neposkytl však užší špičky než direct injection (očekávané mírné rozšíření šířky bazálních špiček).
• Rozumné objemy naložení (0.05–0.25 µL) dávaly srovnatelné identifikace; velmi velké objemy (7.5 µL) vedly k ~13% snížení peptidových identifikací pravděpodobně kvůli adsorpci.
• Použití 0.1% TFA v naložení snížilo identifikace jen o 2–4 % a mírně zužovalo špičky (~8 %), indikující kompromis mezi chromatografií a ionizací.

Přínosy a praktické využití metody

• Systém Orbitrap Astral + μPAC Neo Plus umožňuje hlubší a citlivější analýzu nízkých vstupů bez značení, což je vhodné pro single‑cell proteomiku, analýzy vzácných buněčných populací a malé klinické vzorky.
• Load‑dependent DIA parametrizace a použití FAIMS rozšiřují okno aplikovatelnosti při zachování přesnosti kvantifikace a reprodukovatelnosti.
• Trap-and-elute workflow přidává flexibilitu pro práce se vzorky s nižším ředěním nebo potřebu rychlého odsolení, aniž by zásadně snížil proteomickou pokrytí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálší zlepšení citlivosti lze očekávat kombinací pokročilých iontových filtrací (více CV), optimalizovanými DIA schématy a pokročilou softwarovou de‑konvolucí komplexních spekter.
• Miniaturizace a standardizace μPAC výrobního procesu umožní ještě robustnější běh při různých průtocích a širší adopci v laboratorních sítích.
• Integrace s vyššími úrovněmi automatizace přípravy vzorků a adaptivními metodami řízení MS by mohla přinést vyšší propustnost pro klinické zásahy či screeningové studie.

Závěr

Technická poznámka ukazuje, že kombinace Orbitrap Astral MS, FAIMS Pro Duo a μPAC Neo Plus 50 cm kolony poskytuje výrazné zlepšení citlivosti a kvantitativní přesnosti při analýze nízko-naložených proteomických vzorků. Load-dependent optimalizace DIA parametrů a používání FAIMS významně zvyšují počet identifikací a kvalitu kvantifikace. Trap-and-elute workflow přidává praktickou volbu pro manipulaci s většími objemy při mírné chromatografické kompromise. Celkově jde o robustní a vysoce citlivé řešení pro moderní low-input proteomiku.

Reference

1. Hebert AS, Prasad S, Belford MW, Bailey DJ, McAlister GC, Abbatiello SE, Huguet R, Wouters ER, Dunyach J‑J, Brademan DR, Westphall MS, Coon JJ. Comprehensive single‑shot proteomics with FAIMS on a hybrid Orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 2018;90(15):9529–9537.
2. Thermo Fisher Scientific. Thermo Scientific μPAC Neo Plus HPLC columns: Use and care instructions (Instruction Sheet DOC018). 2025.
3. Frankenfield AM, Ni J, Ahmed M, Hao L. Protein contaminants matter: Building universal protein contaminant libraries for DDA and DIA proteomics. bioRxiv. 2022;2022.04.27.489766.
4. Renuse S, Damoc E, Arrey TN, Salvato F, Delanghe B, Webb S. Deeper proteome coverage and faster throughput for low input samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer (Technical Note TN002255). Thermo Fisher Scientific. 2023.