A decade of DBS steroid innovation in the German Sports University Cologne

Shrnutí případu: Deset let vývoje detekce steroidních esterů v DBS a průlom díky Stellar hmotnostnímu spektrometru

Význam tématu

Detekce anabolických steroidů je klíčová pro antidopingové programy. Dried blood spot (DBS) sampling nabízí výhody jako nízkou invazivitu, snadnou logistiku a menší riziko manipulace se vzorkem. Hlavní analytickou výzvou jsou však velmi malé objemy vzorku, komplexní matricové pozadí, rychlá hydrolýza esterů a nízké endogenní koncentrace. Řešení těchto problémů umožní rozšíření DBS do rutinního anti-dopingového testování a zvýší flexibilitu při odběrech mimo soutěžní období.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem studie bylo shrnout vývoj metodiky detekce intactních (nederivátovaných) steroidních esterů z DBS za desetiletí výzkumu v Centru prevence dopingu v Kolíně nad Rýnem a popsat, jak nový Stellar mass spectrometer umožnil přechod od derivatizovaných postupů k citlivému, robustnímu a rutinně použitelnému LC-MSn protokolu (tMS3). Studie demonstruje analytickou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost pro reálné vzorky a hodnotí provozní dopad pro antidopingová laboratoř.

Použitá metodika

• Vzorek: 20 µL sušené plné krve (DBS) na různých kartách (DMPK, TASSO).
• Původní postupy (2014): multi-krok extrakce a derivatizace (methyloxime) pro zvýšení citlivosti; HRAM PRM (Q Exactive Plus) pro detekci.
• Současný přístup (2025): přímá analýza nativních steroidních esterů bez derivatizace pomocí LC-MSn s tMS3 akvizicí na Stellar MS; post-acquisition XIC pro výběr diagnostických iontů pro kvalifikaci a kvantifikaci.
• Analytické principy: kombinované použití ion-trap resonant RF CID (MS2) a beam-type HCD (MS3) pro vytvoření většího počtu diagnostických produktových iontů a snížení matricového pozadí.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Stellar Mass Spectrometer — hybridní kvadrupól/duální tlak lineární iontrap s automatizovaným řízením ionových paketů, dynamickým AGC a normalizovanou kolizní energií (NCE).
• V dřívějších etapách: Thermo Scientific Q Exactive Plus (Orbitrap) používaný pro HRAM PRM v roce 2014.
• LC systém kompatibilní s DBS extrakcí a chromatografickým rozlišením nezbytným pro separaci isomerů a potlačení pozadí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Průlom: poprvé bylo prokázáno citlivé zjištění 17 nativních steroidních esterů z DBS pomocí tMS3 na Stellar MS.
• Citlivost: sub-ng/mL hladiny (≤ 0,1 ng/mL) pro většinu esterů, což umožňuje detekci stopových množství ve velmi malém objemu krve.
• Selektivita a specifita: použití sekvenčního CID→HCD (tMS3) vedlo k čistšímu pozadí a více diagnostickým iontům; v testech 0/10 blanků vykázalo interferenci na kartách TASSO a DMPK.
• Recovery a carryover: navýšené procento návratu extrakce 43–85 % navzdory matricovým efektům; carryover méně než 1 %.
• Reprodukovatelnost: stabilní poměry iontů vyhovující kritériím WADA IDCR, umožňující potvrzovací screening bez derivatizace.
• Porovnání s tMS2: samotné MS2 mělo omezenou selektivitu kvůli společným produktovým iontům matice; tMS3 vytvořilo více specifických přechodů a zlepšilo poměr signál/šum.

Přínosy a praktické využití metody

• Žádná derivatizace → zkrácení pracovní doby, snížení složitosti a vyšší propustnost laboratorních workflow.
• Unifikovaná metoda pro více analytů (17 esterů) s konzervovanými nastaveními MS3, což zjednodušuje validaci a rutinní provoz.
• Možnost přímé identifikace exogenních esterů v krvi bez nutnosti IRMS, což poskytuje okamžitou indikaci exogenního původu.
• Dobrá kompatibilita s různými DBS zařízeními, vhodné pro screening mladých sportovců, vzdálené sběry a out-of-competition testování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření cílového spektra: aplikace tMS2/tMS3 pro jiné malé molekuly, metabolity a vybrané peptidové hormony vyžadující vyšší strukturální konfirmační informaci.
• Integrace do automatizovaných DBS zpracovatelských linek pro vysokopropustné testovací programy.
• Další zlepšení chromatografie pro separaci strukturálních izomerů a eliminaci zbytkových matricových interferencí.
• Možné doplňkové použití Stellar MS jako doplňku k močovým testům (ne náhrada), poskytující rychlé a spolehlivé důkazy o užití esterifikovaných forem steroidů.

Závěr

Vývoj od derivatizovaných postupů v roce 2014 k nativnímu LC-tMS3 workflow v roce 2025 představuje významný krok k rutinnímu nasazení DBS v anti-dopingu. Stellar MS umožňuje dosáhnout potřebné citlivosti a selektivity bez derivatizace, zjednodušuje pracovní postupy a otevírá nové provozní možnosti pro testování mimo soutěž. Metoda posouvá DBS z konceptu do prakticky využitelného nástroje, přičemž další výzvou zůstává širší validace v provozních laboratořích a integrace do existujících testovacích sítí.

Reference

1. Tretzel LT. Use of dried blood spots in doping control analysis of anabolic steroid esters. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2014, 96, 21-30.
2. Yuan YX. Detection of 20 endogenous anabolic steroid esters with Girard’s Reagent P derivatization in dried blood spots using UPLC-Q-Orbitrap MS. Journal of Chromatography B 2022, 1213, 123535.
3. Jing JS. Automated online dried blood spot sample preparation and detection of anabolic steroid esters for sports drug testing. Drug Testing & Analysis 2022, 14, 1-13.
4. Solheim SA. Stability and detectability of testosterone esters in dried blood spots after intramuscular injection. Drug Testing & Analysis 2022, 14, 1926-1937.
5. Miyamoto AO. Simultaneous detection of testosterone, nandrolone, and boldenone esters in dried blood spots for doping control in sports by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Drug Testing & Analysis 2025, 17(1), 42-55.
6. Thomas AT. Simplified analysis of native steroid esters in dried blood spots by LC-MS3. Journal of Mass Spectrometry 2025.