GC-MS-IRMS: Undisputable results by coupling of GC-IRMS with high-resolution mass spectrometry for final confirmation in sports drug testing

Význam tématu

Analýza 13C/12C izotopových poměrů anabolických steroidů hraje klíčovou roli při prokazování umělého podání hormonů v antidopingové kontrole. Tradiční GC-IRMS dovoluje odlišit endogenní steroidy od syntetických analogů na základě rozdílů v izotopových poměrech vyplývajících z izotopové frakcionace rostlinného materiálu. Pro eliminaci interferencí a potvrzení identity látek je však žádoucí zkombinovat informace o struktuře a přesné hmotnosti získané z vysokorozlišeného GC-MS systému.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje hyphenaci systémů Thermo Scientific GC-IRMS (Delta V™ nebo 253 Plus™) s Orbitrapovým Q Exactive GC™, propojeným s Trace™ 1310 GC. Cílem je simultánně získat kvantitativní izotopové údaje (δ13C) a vysoce selektivní kvalitativní/kvantitativní informace o analýze steroidů v jednom běhu, čímž se zvýší spolehlivost potvrzování pozitivních nálezů v dopingových testech.

Použitá metodika a instrumentace

Pro izolaci steroidů z moče byla použita kombinace SPE, LLE a dvoustupňové HPLC frakcionace (7 frakcí obsahujících klíčové steroidy: TESTO, 5α-DIOL, 5β-DIOL, ETIO, DHEA, …). Derivativizace na acetáty zlepšila chromatografické vlastnosti.

• GC IsoLink II konverzní jednotka (kombustní a vysokoteplotní převod na CO2, H2O)
• IRMS: Delta V Plus nebo 253 Plus (m/z 44, 45, 46 na Faradayových detektorech)
• GC-MS: Q Exactive GC Orbitrap s EI ionizací, rozlišení 120 000 (FWHM), rozsah m/z 50–600
• GC: Thermo Scientific Trace 1310 s kapilární kolonkou TraceGold TG-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm)
• Autosampler: TriPlus RSH, splitless injekce, režim 1 µL, He 1,5 mL/min

Hlavní výsledky a diskuse

Ve výkresech IRMS byl zachycen chromatogram frakce 11-KETO a zároveň signál m/z 44 s odpovídajícím izotopovým poměrem 45/44 pro ověření čistoty piku. Systém dovolil sledovat δ13C hodnoty TESTO, 5α-DIOL a 5β-DIOL po administraci 30 mg testosteronu u dobrovolníka až do 24 h. Rozdíly mezi target compounds (TC) a endogenními referenčními sloučeninami (ERC) dosahovaly >3 ‰, což splňuje kritéria WADA. Orbitrapová MS část potvrdila identitu píků pomocí vysoké hmotnostní přesnosti (<2 ppm) a srovnání se spektrem NIST. Nežádoucí koeluce byly odhalitelné díky narušenému izotopovému průběhu v GC-IRMS.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje v jediném běhu získat:

• absolutní izotopové poměry pro prokazování syntetického původu
• přesnou strukturální identifikaci minoritních a koelujících látek
• vysokou citlivost a selektivitu bez nutnosti samostatných analýz

Výsledkem je spolehlivější potvrzování pozitivních nálezů v dopingových laboratořích akreditovaných WADA.

Budoucí trendy a možnosti využití

Systém vysokorozlišeného GC-MS/IRMS lze aplikovat pro non-target screening nových metabolitů a dopingových látek, retrospektivní vyhledávání sloučenin a rozšíření do forenzních či environmentálních studií. Využití vysoké hmotnostní přesnosti a dlouhé detekční okno nabízí potenciál pro rozvoj metod v regulatorním i neregulačním prostředí.

Závěr

Propojení GC-IRMS se systémem Q Exactive GC Orbitrap výrazně zvyšuje spolehlivost dopingové analýzy kombinací izotopových dat s vysokou selektivitou a hmotnostní přesností. Umožňuje potvrdit čistotu píků i identitu minoritních koelujících sloučenin v jednom měření, čímž zlepšuje kvalitu a důvěryhodnost výsledků v praxi.

Reference

1. WADA Technical Document, TD2016IRMS.
2. Piper T., Mareck U., Geyer H., Flenker U., Thevis M., Platen P., Schänzer W. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008, 22, 2161.
3. Piper T., Thomas A., Thevis M., Saugy M. Drug Test. Analysis 2012, 4, 717.
4. Docherty G., Jones V., Evershed R. P. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001, 15, 730.