Selective and sensitive quantitation of 18 steroids in human serum using Stellar mass spectrometer

Význam tématu

Citlivá a selektivní kvantifikace steroidů v biologických matricích je klíčová pro klinický výzkum, diagnostiku a monitorování hormonálních stavů pacientů. Nízké koncentrace steroidů v séru a rušivé matrice vyžadují metody s vysokou specifitou, které minimalizují interferenci a zaručují spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na demonstraci možnosti kvantifikovat 18 steroidů v lidském séru s využitím hybridního kvadrupólu – lineárního iontového pasti Stellar MS. Cílem bylo optimalizovat ionizační a fragmentační podmínky (HCD, CID, MS3) a vybrat nejvhodnější skenovací režimy pro maximální citlivost a selektivitu.

Použitá metodika a instrumentace

Úprava vzorků:

• Proteinová precipitace acetonitrilem s kyselinou octovou z 160 µL séra.
• Rekonce nstituce v 100 µL 50% methanolu, injekce 5 µL.

Chromatografie:

• Vanquish Horizon UHPLC, kolona Kinetex C18 (2,1×150 mm, 2,6 µm), 50 °C.
• Gradient s mobilními fázemi voda/0,05 mM NH4F a methanol/0,05 mM NH4F během 16 minut.

Hmotnostní spektrometrie Stellar MS:

• Hybridní kvadrupól – dual-pressure lineární iontová past.
• Fragmentační režimy HCD (beam-type) a CID (resonanční) s MS2 a MS3.
• Zdroj OptaMax Plus, vaření iontového přenosu 325 °C, vaporizér 525 °C.
• Software Xcalibur 4.7 pro akvizici, TraceFinder 5.2 pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace fragmentačních podmínek:

• Workflow určení kolizní energie (CE) pro jednotlivé steroidy v MS2 and MS3 pomocí rampování CE a vyhodnocení intenzity produktových iontů.
• Výběr nejvhodnějších dávek CE pro HCD, CID a MS3 zajistil vysokou signál-šum poměr a stabilní kvalifikační iontové poměry.

Kvantifikace a limity detekce:

• Lineární kalibrační křivky s vahou 1/x pro koncentrace pokrývající 4 řády, R2 > 0,99.
• LOQ v rozsahu 0,01–2,00 ng/mL, inter-denní RSD < 11,5 %, iontová poměr < 20 %.

Příklad DHT:

• MS2-HCD vykazovalo značný background pro kvalifikační ionty m/z 173.
• MS3 fragmentace významně potlačila pozadí a zlepšila citlivost i selektivitu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou citlivost a selektivitu díky alternativním MS3 fragmentačním režimům.
• Rychlé skenování (1100 ms cyklus) umožňuje současnou optimalizaci 18 analyty a 16 interních standardů.
• Úsporu času a zdrojů díky vyhodnocení všech skenovacích režimů v jedné injekci.

Praktické využití v klinických laboratořích a výzkumných projektech zaměřených na steroidní biomarkery.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zkrácení retenčních časových oken pro vyšší průtok vzorků v rámci jednoho běhu.
• Implementace dalších molekulárních tříd pomocí MS3 strategií pro komplexní metabolomické studie.
• Využití pokročilých datových analýz a umělé inteligence pro automatickou optimalizaci podmínek.
• Rozšíření metodiky pro drobné molekuly a farmakokinetické studium léčiv.

Závěr

Stellar MS s hybridním kvadrupólem a lineární iontovou pastí prokázal vynikající výkon v citlivé a selektivní kvantifikaci 18 steroidů v séru. Optimalizace MS2 a MS3 podmínek vedla k nízkým LOQ, stabilním kalibracím a nízkým RSD. Metoda nabízí rychlý, robustní a vysoce průchodný workflow vhodný pro klinické i výzkumné aplikace.

Reference

1. Remes P. M. et al., J. Proteome Res. 2024, 5476.