Optimization of RPLC-UV methods for impurity analysis of the GLP-1 receptor agonists semaglutide and tirzepatide

Optimalizace RPLC-UV metod pro analýzu nečistot semaglutidu a tirzepatidu

Význam tématu

GLP‑1 receptoroví agonisté semaglutid a tirzepatid jsou syntetické peptidové léky s rostoucím využitím v léčbě diabetu 2. typu a v terapii redukce hmotnosti. Vzhledem k jejich složitému sekvenčnímu složení a modifikacím (aminokyselinné substituce, konjugace mastných kyselin) mohou vznikat strukturálně velmi podobné peptidové nečistoty. Robustní chromatografické metody jsou proto nezbytné pro identifikaci, kvantifikaci a kontrolu těchto nečistot v průběhu výroby i skladování a pro splnění regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo systematicky vyvinout a nabídnout optimalizované reversed‑phase LC (RPLC) metody s UV detekcí pro separaci a analýzu nečistot semaglutidu a tirzepatidu. Studie hodnotila vliv stacionární fáze (Hypersil GOLD C4 vs. Hypersil GOLD Peptide), organického modifikátoru (acetonitril vs. methanol), kyselých přísad (formiová vs. trifluoroctová kyselina) a teploty kolony. Pracovalo se s termicky degradovanými vzorky API (>99 %), aby se získal reprezentativní profil nečistot.

Použitá metodika a přehled experimentu

Vzorky: 1 mg/mL roztoky API připravené v 20 % ACN/voda; vzorky tepelně stresovány při 60 °C po 7 dnů.

Screening: Porovnání dvou kolonních chemických modifikací a čtyř kombinací mobilních fází (MeOH/ACN × FA/TFA). Testovány fixní generické gradienty pro přímé srovnání; dále optimalizace gradientu a teploty kolony (30–60 °C). Hodnocení bylo založeno na počtu detekovaných nečistot >0,1 % relativní plochy, tvaru špiček a rozlišení od hlavního API.

Použitá instrumentace

Seznam hlavních přístrojů a komponent použitých ve studii:

• Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC systém: System Base, Binary Pump F VF‑P10, Split Sampler FT, Column Compartment H, Diode Array Detector (Vanquish DAD FG) s bio flow cell 11 μL (10 mm).
• Chromeleon CDS 7.3.2 pro akvizici a zpracování dat.
• Kolony: Hypersil GOLD Peptide 150 × 2.1 mm, 1.9 μm; Hypersil GOLD C4 150 × 2.1 mm, 1.9 μm.
• Ve vzorcích a mobilních fázích: acetonitril (ACN), methanol (MeOH), formiová kyselina (FA) a trifluoroctová kyselina (TFA), deionizovaná voda z Barnstead GenPure.
• Parametry DAD: 280 nm, sběr 2.0 Hz, response time 2.0 s; průtok 0.3 mL/min; inj. objem 5 μL; autosampler 5 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Výběr kolony a mobilní fáze

- Mobilní fáze a její kyselá přísada byly primárním faktorem ovlivňujícím selektivitu separace; rozdíly v ligandové délce kolony (C4 vs. peptide) měly menší, ale stále významný vliv.
- Nejlepší počty detekovaných nečistot pro oba analyty dosáhly podmínky s Hypersil GOLD C4 v kombinaci s MeOH a TFA (u semaglutidu i tirzepatidu). Metody založené na TFA vykazovaly výrazně lepší tvar špiček a rozlišení než FA při zachování stejných podmínek.

Vliv teploty kolony

- Obecně zvýšení teploty zlepšilo rozlišení většiny nečistot (nejčastěji 60 °C). Nicméně u některých kombinací (např. semaglutid na C4 s TFA) vedlo zvýšení teploty k horšímu rozlišení a k souběhu dvou nečistot. To ilustruje, že teplotní optimalizace musí být prováděna pro každou kombinaci kolony/mobilní fáze zvlášť.
- Pozorován byl odlišný trend pro MeOH vs. ACN: s MeOH se retenční časy s rostoucí teplotou významně zkracovaly, zatímco u ACN mírně narůstaly — pravděpodobně důsledek odlišných peptide–rozpouštědlových interakcí a změn konformace peptidů modifikovaných mastnými kyselinami.

Optimalizace gradientu

- Po úpravě gradientů (shallow gradients, prodloužené časy v oblasti eluce API) došlo k významnému zlepšení rozlišení a k odhalení dalších koelujících nečistot. Celková relativní plocha nečistot se u TFA metod zvýšila po optimalizaci o ~1,5 % (semaglutid) a ~2,1 % (tirzepatid), což znamená detekci dříve přehlédnutých komponent.

Souhrn praktických pozorování

- Malé strukturální rozdíly mezi semaglutidem a tirzepatidem ovlivňují chromatografické chování (tirzepatid vykazoval delší retenci při shodných podmínkách).
- Formiová kyselina zůstává užitečná pro metody kompatibilní s LC‑MS, zatímco TFA poskytuje lepší chromatografickou výkonnost pro čistě UV‑metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Poskytnuté optimalizované metody představují funkční startovací body pro analýzu nečistot GLP‑1 RAs v QC a vývojových laboratořích.
• Systematický screening kolona × organika × modifikátor s následnou teplotní a gradientní optimalizací umožňuje rychlejší vývoj robustních RPLC‑UV metod pro podobné peptidové API.
• FA‑podmínky nabízejí kompatibilitu s následnou LC‑MS identifikací, TFA‑podmínky zlepšují kvalitu separace při UV detekci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace optimalizovaných UV metod s HR‑MS pro struktury nečistot: kombinace TFA‑UV pro screening a FA‑LC‑MS pro identifikaci.
• Využití designu experimentu (DoE) pro kvantitativní mapování vlivu teploty, složení organiky a pH/modifikátorů na separaci peptidů.
• Rozvoj kolonních materiálů šitých na míru pro mastně modifikované peptidy a širší implementace bio‑kompatibilních flow buněk pro snížení sorpce.
• Automatizované workflows pro sledování stability API během shelf‑life studií s pravidelným screenováním více metod.

Závěr

Studie demonstruje, že systematické testování stacionární fáze, organického modifikátoru, kyselého přísad a teploty kolony spolu s cílenou optimalizací gradientu vede k výraznému zlepšení separace nečistot u semaglutidu a tirzepatidu. Metody založené na Hypersil GOLD C4 s MeOH/TFA a na Hypersil GOLD Peptide s ACN/FA byly identifikovány jako vhodné šablony, přičemž konečný výběr parametrů musí být vždy přizpůsoben konkrétnímu analyzovanému peptidu a plánovanému analytickému workflow.

Reference

1. Buntz B. 2024’s blockbusters: Top 50 drugs by sales, 2024.
2. U.S. Department of Health and Human Services, FDA, CDER. ANDAs for Certain Highly Purified Synthetic Peptide Drug Products That Refer to Listed Drugs for rDNA Origin, Guidance for Industry, 2021.
3. Chen Y., Mant C. T., Hodges R. S. Temperature selectivity effects in reversed‑phase liquid chromatography due to conformation differences between helical and non‑helical peptides. Journal of Chromatography A, 2003, 1010(1), 45.
4. Gilar M., Jaworski A., McDonald T. S. Solvent selectivity and strength in reversed‑phase liquid chromatography separation of peptides. Journal of Chromatography A, 2014, 1337, 140.