Stability-indicating HPLC-UV method development for GLP-1 receptor analogue semaglutide

Význam tématu

Semaglutid je 32-aminokyselinový agonista GLP‑1 receptoru široce užívaný v léčbě diabetu 2. typu a při řízení tělesné hmotnosti. S rostoucím počtem generických projektů a přísnými regulatorními požadavky na identifikaci a kontrolu nežádoucích produktů rozkladu u syntetických peptidů je potřeba robustních, stability‑indikujících analytických metod. Validní HPLC‑UV metoda pro kvantifikaci semaglutidu a souvisejících nečistot je proto klíčová pro vývoj, kontrolu kvality a stabilitní studie.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout stability‑indikující reverzně‑fázovou HPLC‑UV metodu pro analýzu semaglutidu a jeho příbuzných nečistot s využitím Thermo Scientific Hypersil GOLD Peptide kolony. Studie zkoumala vliv teploty kolony, gradientu a složení mobilní fáze (formiová vs. trifluoroctová kyselina) na separaci, optimalizovala podmínky pro rozlišení kritických, blízko elujících píků a ověřila reprodukovatelnost mezi různými výrobními šaržemi kolon.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC (binární pumpa, split sampler, column compartment s aktivním předhříváním, VWD detektor, bio flow bunka 11 µL).
• Kolona: Hypersil GOLD Peptide, 150 × 2.1 mm, 1.9 µm.
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1% FA nebo 0.1% TFA; B = acetonitril + 0.1% FA nebo 0.1% TFA.
• Optimální podmínky: průtok 0.3 mL·min⁻¹, teplota kolony 55 °C (aktivní předhřívač), autosampler 4 °C, injekční objem 5 µL, VWD na 280 nm.
• Příprava vzorku: semaglutid API (>99 %) rozpuštěn v 20 % ACN ve vodě na 1.0 mg·mL⁻¹; stresové vzorky: termické (60 °C, 8 dní) a oxidační (0.01 % H₂O₂, 14 h).
• Gradient pro finální metodu: 30 % → 50 % organiky (B) během 40 minut (celková běhová doba ~60 min včetně re‑equilibrace).

Hlavní výsledky a diskuse

• Stresové studie: Termické a oxidační ošetření generovalo úrovně degradace kolem 10.1 % (termické) a 4.9 % (oxidační), vhodné pro optimalizaci separace a identifikaci souvisejících nečistot.
• Vliv teploty kolony: Zvýšení teploty z 35 °C na 55 °C obecně zlepšilo rozlišení blízko elujících píků. U kritického píku před semaglutidem se rozlišení zvýšilo z 0.45 (35 °C) přes 0.57 (45 °C) až na 0.72 (55 °C). Většina sledovaných párů vykázala progresivní zlepšení rozlišení s rostoucí teplotou; několik píků se změnilo nepatrně v retenci bez zhoršení separace.
• Optimalizace gradientu: Testovány byly počáteční a konečné %B (25–60, 30–50, 35–50). Nejefektivnější kompromis mezi rozlišením a citlivostí byl nalezen pro gradient 30→50 % B během 40 minut, kdy se u semaglutidu zkrátil šířkový profil (lepší citlivost) a kritické nečistoty byly odděleny.
• Porovnání FA vs. TFA: FA (formiová kyselina) vyhovuje LC‑MS kompatibilitě, ale poskytla horší chromatografické rozlišení a širší píky v porovnání s TFA. Použití 0.1 % TFA vedlo k výraznému zlepšení rozlišení a tvaru píků, vyřešilo dříve koelující složky (zejména v oxidačně stresovaných vzorcích) a zlepšilo analytickou citlivost. Nevýhodou TFA je omezená kompatibilita s MS (ion‑suppression), proto je třeba volbu aditiva zvážit podle účelu analýzy (UV/QC vs. LC‑MS charakterizace).
• Reprodukovatelnost mezi šaržemi kolony: Pro finální TFA‑metodu byla ověřena lot‑to‑lot konzistence na třech výrobních šaržích kolony pomocí šestinásobných injekcí thermálně stresovaného vzorku. %RSD parametrů (retence, RRT, výška piku, šířka piku 50 %, plocha) byly ≤1.3 %, což potvrzuje vynikající robustnost a vhodnost metody pro rutinní použití.

Přínosy a praktické využití metody

• Stability‑indikující metoda umožňuje spolehlivou kvantifikaci semaglutidu a separaci klíčových produktů rozkladu, což je zásadní pro kontrolu kvality, stabilitní studie a vývoj generických formulací.
• Metoda je optimalizovaná pro UHPLC s krátkou kolonou a jemným částicovým plnivem, což přináší dobrou citlivost a krátké doby analýzy při zachování rozlišení.
• Pro rutinní QC (HPLC‑UV) doporučené použití TFA poskytuje nejlepší chromatografickou výkonnost; pro metody vyžadující MS detekci je vhodné použít FA nebo provést paralelní LC‑MS metodiku s korekcí pro snížené rozlišení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj bude směřovat k metodám kompatibilním s LC‑MS, které kombinují dobré chromatografické rozlišení s vysokou citlivostí pro identifikaci struktur nečistot (např. použití méně potlačujících iontizačních modifierů nebo post‑sloupcové neutralizace TFA).
• Rozvoj peptidově‑specifických fází a modifikovaných stacionárních fází pro lepší separaci isomerů a modifikovaných aminokyselin.
• Automatizace stresových studií, multivariantní optimalizace (DoE) a přenositelnost metod mezi laboratořemi a platformami budou klíčové pro zrychlení registrací generik a posílení shody s regulačními požadavky.
• Integrace vysokorozlišovací MS pro detailní charakterizaci rozpadových produktů a pro podporu definice přípustných limitů nečistot.

Závěr

Byla vyvinuta a optimalizována stability‑indikující HPLC‑UV metoda pro semaglutid využívající Hypersil GOLD Peptide kolonu. Finální podmínky zahrnují aktivní předhřívání kolony na 55 °C, gradient 30→50 % B v 40 minutách a 0.1 % TFA v mobilní fázi, což vedlo k vynikajícímu rozlišení kritických nečistot a k nízké mezišaržové variabilitě (%RSD ≤1.3 %). Metoda je vhodná pro rutinní QC a stability studie; volba aditiva však závisí na požadavcích na kompatibilitu s MS a na cílech analýzy.

Reference

1. Buntz B. 2024’s blockbusters: Top 50 drugs by sales. Drug Discovery Trends, 2024.
2. U.S. Department of Health and Human Services, FDA, CDER. ANDAs for Certain Highly Purified Synthetic Peptide Drug Products That Refer to Listed Drugs for rDNA Origin: Guidance for Industry. 2021.
3. Field JK, Euerby MR, Haselmann KF, et al. Investigation into Reversed‑Phase Chromatography Peptide Separation Systems Part IV: Characterisation of Mobile Phase Selectivity Differences. Journal of Chromatography A. 2021;1641:461986. doi:10.1016/j.chroma.2021.461986.
4. Heidorn M. The Role of Temperature and Column Thermostatting in Liquid Chromatography. Thermo Fisher Scientific, White Paper 71499.