Using an FTIR Spectrometer to Analyze How a Bacterial Culture is Affected by Differences between Culture Medium Ingredients (Peptones and Yeast Extracts)

Význam tématu

Kontrola kvality a stabilita výrobních procesů založených na mikroorganismech silně závisí na konzistenci složení kultivačního média. Přirozeně získané složky média, jako peptony a výtažky z kvasnic, vykazují mezi šaržemi a mezi výrobci variabilitu, která může ovlivnit růst, metabolismus a výslednou kvalitu produktu. Použití FTIR spektrometrie jako rychlé, neinvazivní a citlivé metody umožňuje sledovat změny v biomolekulárním složení mikrobiálních kultur a tím podporuje kontrolu surovin i výrobního procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce bylo ukázat, že FTIR spektrometrie (s použitím přístroje IRXross a diffuse reflectance příslušenství DRS-8000) dokáže rozlišit vliv různých peptonů a výtažků z kvasnic na kultivaci bakterie Staphylococcus cohnii ATCC 29974. Studie porovnala komerční a několikeré interně připravené kultivační média (různé zdroje peptonů a různé výrobce/šarže výtažků z kvasnic) za konzistentních kultivačních podmínek a analyzovala výsledné buněčné suspenze pomocí FTIR spekter doplněných o druhou derivaci a multivariační analýzu (PCA, cluster analysis).

Použitá metodika

Popis vzorkování a přípravy:

• Kultivace: S. cohnii, 37 °C, 24 h; každý typ média třikrát (n = 3).
• Příprava vzorku: odstředění celé kultury, vyplach v fyziologickém roztoku, resuspendace v ultrapure vodě, doplnění na 70 % ethanolu, homogenizace zirconovými kuličkami, nanesení 5 μL na 64-well mikrofocus destičku a vysušení.

Spektrální zpracování a datová analýza:

• Technika: DRS-FTIR (diffuse reflectance) s plně purgeovaným systémem (dusík) pro omezení par a CO2.
• Předzpracování spekter: druhá derivace (Savitzky–Golay filtrace), výběr oblasti 1300–800 cm−1, unit-vector normalizace.
• Multivariační analýzy: PCA a hierarchické shlukování (metoda averages, Eukleidovská vzdálenost) na průměrech replik.

Použitá instrumentace

Seznam přístrojů a provozních parametrů použitých ve studii:

• FTIR spektrometr: IRXross (Shimadzu).
• Diffuse reflectance příslušenství: DRS-8000 (custom model).
• Detektor: DLATGS.
• Rozlišení: 4 cm−1.
• Počet průměrovaných skenů: 20.
• Apodizační funkce: SqrTriangle.
• Purge plyn: dusík pro snížení vodní páry a CO2 v průběhu měření.
• Automatizované softwarové měření DRS (automated DRS measurement software).

Hlavní výsledky a diskuse

Spektroskopické pozorování:

• V surových FTIR spektrách byly profily jednotlivých kultur na první pohled podobné. Po aplikaci druhé derivace se však objevily rozdíly zejména v oblasti kolem 1050 cm−1 a 900 cm−1, které odpovídají změnám v sacharidových, polysacharidových a dalších buněčných komponentách/metabolitech.

Peptony:

• Mezi testovanými peptony vystoupily dvě media jako odlišné: komerční pepton (PA) tvořil samostatný shluk a plant‑based pepton (PF) byl výrazně oddělený od ostatních. PF vykazoval slabý růst bakterie, což pravděpodobně vysvětluje výrazné spektrální odlišnosti (změněný poměr biomolekul/metabolitů v buňkách při suboptimálních růstových podmínkách).
• Ostatní vnitřní šarže peptonů (PB–PE) se seskupily blízce, což naznačuje podobný vliv na stav kultury.

Výtažky z kvasnic:

• Loty YD_lot1 a YD_lot2 byly v analýzách vzájemně blízko a nevykazovaly zjevnou lot-to-lot variabilitu. Naopak YE tvořilo separátní, odlehlý shluk spojený s horším růstem (opět rozdílné spektrální rysy spojené s narušeným metabolizmem).
• Rozdíl mezi YB_STD a YB_HQ naznačuje, že i kvalita/grade výtažku od stejného výrobce může ovlivnit metabolický stav kultivovaných buněk.

Interpretační poznámka:

Silné odchylky v FTIR profilech často korelují s narušeným růstem; proto je důležité kombinovat spektrometrické poznatky s informacemi o růstových parametrech (biomasa, viabilita) při rozhodování o akceptaci surovin.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické aplikace FTIR při výrobě mikrobiálních produktů:

• Rychlý skríning a akceptanční testování vstupních surovin (peptony, výtažky z kvasnic) pro zajištění konzistence výroby.
• Detekce abnormálních změn v kultivačním procesu způsobených šaržovými odchylkami surovin.
• Podpora equivalence testingu při zaměňování nebo úpravě složek kultivačního média.
• Výhody DRS: možnost analýzy více vzorků, jednoduchá údržba a příprava povrchu (vhodné pro rutinní QC).

Budoucí trendy a možnosti využití

Několik směrů, které mohou rozšířit užitečnost FTIR v oblasti bioprodukce:

• Integrace FTIR dat s pokročilými strojovými učícími metodami a chemometrií pro robustnější klasifikaci, predikci růstových parametrů a automatizované upozornění na odchylky.
• Vývoj standardizovaných spektrálních knihoven pro různé typy peptonů a výtažků z kvasnic, které umožní rychlou identifikaci problematických šarží.
• Implementace inline nebo at‑line FTIR/DRS řešení jako součást Process Analytical Technology (PAT) pro průběžné monitorování fermentačních procesů.
• Rozšíření analýzy na širší spektrální oblasti a multimodální senzory (např. kombinace s Raman spektroskopií) pro zvýšení senzitivity vůči specifickým metabolitům.

Závěr

Studie demonstruje, že FTIR spektrometrie v režimu DRS je účinným nástrojem pro sledování vlivu variací v kultivačním médiu na metabolismus a složení buněk S. cohnii. Kombinace spektrální analýzy (druhá derivace, oblast 1300–800 cm−1) s multivariačními metodami (PCA, shlukování) umožnila jednoznačně identifikovat médium, které negativně ovlivnilo růst (PF pro peptony, YE u výtažků z kvasnic) a prokázat, že i rozdíly mezi šaržemi nebo kvalitou suroviny mohou být detekovatelné. FTIR tak má významné uplatnění v QC surovin, při změnách složení média a pro detekci abnormalit v bioprodukčních procesech.

Reference

1. Lasch P., Naumann D. Infrared Spectroscopy in Microbiology. Encyclopedia of Analytical Chemistry, 3: 1–32, 2015.
2. Shimadzu Corporation / JSR Corporation. Application News: Using an FTIR Spectrometer to Analyze How a Bacterial Culture is Affected by Differences between Culture Medium Ingredients (Peptones and Yeast Extracts). First Edition: Sep. 2026.