Using FTIR to Detect and Differentiate Microbial Contamination at the Species Level during the Production of Microbial Products

Význam tématu

FTIR spektroskopie poskytuje rychlý a neinvazivní způsob charakterizace mikroorganismů na základě jejich molekulárních složek (lipidy, proteiny, polysacharidy, sacharidy). V kontextu výroby mikrobiálních produktů je včasná detekce kontaminace klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti. Metoda umožňuje monitorování velkého počtu vzorků s krátkým časem analýzy, což je výhodné pro provozy s vysokou frekvencí kontroly.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsaného projektu bylo ověřit, zda je možné pomocí FTIR (difuzní reflexe) detekovat a odlišit kontaminaci na úrovni druhu mezi bakteriemi stejného rodu. Konkrétně šlo o rozlišení kontaminace kultury Staphylococcus cohnii přídavkem Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermidis při velmi nízkých počátečních podílech (10^-2 až 10^-7 %). Analýza porovnávala spektrální zpracování (druhá derivace) s multivariačními metodami (PCA, shluková analýza) a výsledky byly ověřeny kvantitativním real-time PCR.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Centrifugace celé kultury a odstranění supernatantu.
• Promytí fyziologickým roztokem a znovu centrifugace.
• Resuspendace v ultrapure vodě, následné doplnění na 70 % ethanol.
• Homogenizace pomocí zirkoniových kuliček a obnovení suspenze.
• Nanesení 5 µL na mikro‑fokus destičku (64 jamky) a vysušení; tři replikáty na vzorek.

Spektroskopie a podmínky měření:

• Režim: difuzní reflexní FTIR (DRS) s dusíkovou purží pro redukci vlhkosti a CO2.
• Spektrometr: IRXross vybavený DRS-8000 (custom model).
• Parametry: rozlišení 4 cm^-1, průměr 20 skenů, apodizace SqrTriangle, detektor DLATGS.
• Předzpracování spekter: druhá derivace (Savitzky–Golay), výběr oblasti 1300–800 cm^-1, unit vector normalizace.
• Datová analýza: hlavní komponenty (PCA) a shluková analýza (metoda průměrů, Eukleidovská vzdálenost).

Použitá instrumentace

• FTIR spektrometr: IRXross (Shimadzu).
• Difuzní reflexní příslušenství: DRS-8000 (custom model).
• Mikro‑fokus destička 64 jamky pro vysokoparalelní nanášení 5 µL vzorků.
• Detektor: DLATGS; dusíková purž pro snížení atmosférických interferencí.

Hlavní výsledky a diskuse

Spektrální profily původních FTIR záznamů byly mezi testovanými kulturami velmi podobné, avšak aplikace druhé derivace zvýraznila odlišnosti v oblasti 1300–800 cm^-1, což umožnilo jejich rozlišení pomocí PCA a shlukové analýzy. Konkrétní zjištění:

• FTIR dokázal rozlišit přítomnost S. aureus v kultuře S. cohnii pro počáteční podíly vyšší než ~10^-5 % (detekce po 24 h ko‑kultivace).
• Kontaminaci S. epidermidis metodou FTIR standardně nelze spolehlivě detekovat v použitých podmínkách — zřejmě kvůli jeho omezenému vzrůstu v ko‑kultuře se S. cohnii.
• Real‑time PCR ukázala, že S. aureus při počátečních podílech ≥10^-6 % dokázal během ko‑kultivace převzít větší podíl v populaci, což korelovalo s vyšší detekovatelností FTIR.

Výsledky tedy ukazují, že schopnost FTIR detekovat druhově specifickou kontaminaci výrazně závisí na biologické kompetici kontaminantu (schopnosti růstu) během podmínek kultivace. Chemotypické rozdíly, které FTIR snímá, se projeví jen pokud je kontaminant přítomen v dostatečném relativním množství.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: zkrácená doba analýzy (řádově desítky sekund na vzorek) umožňuje vysokou produktivitu kontrolních měření ve výrobních prostředích.
• Paralelní měření: použití mikro‑fokus destiček a DRS umožňuje více vzorků najednou a usnadňuje manipulaci a čištění.
• Nákladová efektivita: nižší spotřeba reagencií ve srovnání s molekulárně‑biologickými metodami a možnost předběžného screeningu velkého počtu vzorků.
• Komplementární použití: vhodné jako rychlý screening nástroj, jehož pozitivní či podezřelé výsledky lze ověřit cílenými metodami (PCR, kultivace).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých chemometrických a strojově‑učených algoritmů pro zlepšení citlivosti a automatické klasifikace spekter.
• Rozšíření referenčních knihoven spekter pro širší soubor druhů a variant včetně izolátů z průmyslového prostředí.
• Vývoj on‑line nebo at‑line FTIR rozhraní v bioreaktorech pro průběžný monitoring kultivací.
• Kombinace FTIR s molekulárně‑biologickými kvantifikačními metodami (qPCR) pro kvantitativní interpretaci spektrálních změn.
• Zlepšení citlivosti prostřednictvím moderních detektorů, vyššího počtu skenů nebo optimalizace přípravy vzorku (koncentrace, homogenizace).

Závěr

Difuzní reflexní FTIR v kombinaci s derivativním zpracováním spekter a multivariační analýzou umožňuje rychlé a vysoce paralelní rozpoznání některých druhových kontaminací mezi blízce příbuznými bakteriemi. Citlivost však závisí na schopnosti kontaminantu růst během ko‑kultivace a na relativním zastoupení v konečné směsi. Metoda je vhodná pro rychlý screening v produkčních provozech, přičemž pro potvrzení a kvantifikaci je doporučeno doplnit analýzu molekulárně‑biologickými technikami.

Reference

1. Lasch P, Naumann D. Infrared Spectroscopy in Microbiology. Encyclopedia of Analytical Chemistry. 2015;3:1–32.