RNA Sequence Mapping Via Endonuclease Digestion and Lc-MS Analysis Via Novel Informatics Workflows

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé mapování sekvence RNA je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických oligonukleotidů, jako jsou sgRNA a mRNA. Spojení endonukleázové digesce s vysokorozlišovací kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií podporuje detailní analýzu modifikací a ověření integrity sekvencí.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie představuje nové informatikní workflowy pro mapování sekvence 100mer sgRNA a mRNA (GFP, 1019 nt) s využitím aplikací SYNTHETIC Library, MAP Sequence a CONFIRM Sequence na platformě waters_connect. Cílem je demonstrovat dosažení úplného nebo téměř úplného pokrytí sekvence pomocí RNase T1 a nového enzymu RapiZyme MC1 spolu s analýzou na Xevo MRT QTof hmotnostním spektrometru.

Použitá metodika a instrumentace

• Endonukleázové digesce: RNase T1 (specifičnost na G_U) a RapiZyme MC1 (specifičnost na 5'-U a dvě vedlejší místa C_U/C_A/C_G).
• Příprava vzorku: Rozpuštění enzymů v pufrech amoniového uhličitanu (RNase T1) nebo amoniového octanu (MC1), digesní protokoly dle výrobce.
• LC-MS podmínky: ACQUITY Premier UHPLC, kolona OST 1.7 µm 2.1x150 mm; mobilní fáze s DPA a HFIP; gradient 0–50 % B za 45 min; teplota 60 °C; průtok 0.3 mL·min−1.
• MS akvizice: Xevo MRT QTof, data-independent acquisition (MSE) s nízkou energií 6 V a rampou 30–55 V, rozsah 340–4000 Da.
• Informatika: waters_connect Platform 4.1.0.17, SYNTHETIC Library App 2.0.0, MAP Sequence App 2.0.0, CONFIRM Sequence App 1.4.0.13.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro sgRNA standard 100mer bylo dosaženo 100 % pokrytí sekvence kombinací digesce RNase T1 a RapiZyme MC1.
• Pro mRNA (1019 nt) bylo predikováno 86,75 % pokrytí RNase T1 a 85,38 % pokrytí MC1, kombinované pokrytí až 99,9 %.
• Isomerní produkty byly rozlišené pomocí CONFIRM Sequence App a doplňujících fragmentačních dat.
• Xevo MRT QTof poskytuje vynikající rozlišení (~80 000), přesnost (<±3 ppm) a citlivost pro oligonukleotidové analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje spolehlivé ověření úplnosti a integrity terapeutických RNA molekul.
• Podporuje standardizaci a automatizaci v QA/QC procesech výroby oligonukleotidů.
• Eliminuje nutnost ruční interpretace díky automatickému přiřazení digestačních fragmentů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu endonukleáz pro zvýšení kvality sekvenčního pokrytí.
• Integrace strojového učení pro předpověď optimalizovaných digesních podmínek.
• Rozvoj cloudových platforem pro kolaborativní sdílení analýz a dat.

Závěr

Navržené workflowy kombinující specifické enzymy, vysoce výkonnou LC-MS instrumentaci a pokročilou informatiku umožňují komplexní přehled o sekvenci a modifikacích RNA terapeutik. Tyto přístupy posouvají hranice precizní analytické kontroly a sjednocují proces od vstupu sekvence až po report.

Reference

1. Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications, Waters application note P/N 720008539EN, 2024
2. RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow, Waters application note P/N 720008553EN, 2024
3. Grunberg S et al., Enhanced Expression and Purification of Nucleotide-specific Ribonucleases MC1 and Cusativin, Protein Expr Purif, 2022;190:105987
4. Thakur P et al., RNA Cleavage Properties of RNase MC1 and Cusativin, Int J Mol Sci, 2022;23:7021
5. CONFIRM Sequence App for Sequencing of Synthetic Oligonucleotides and Their Impurities, Waters application note P/N 720007677EN, 2022