Chemical Stability Testing of Daraxonrasib Using Ultrashort 2.1 x 10 mm UPLC Columns

Význam tématu

Studium chemické stability kandidátních léčiv je klíčové v raných fázích vývoje, protože nestabilita může zkreslit výsledky in vivo experimentů a vést k chybné interpretaci metabolismu nebo biodistribuce. Rychlé in vitro stability screeningy umožňují předběžné vyřazení nevhodných kandidátů a optimalizují využití nákladných in vivo studií. Použití ultrakrátkých UPLC kolon 2.1 x 10 mm umožňuje drastické zkrácení doby analýzy, zvýšení časového rozlišení degradace a snížení spotřeby organických rozpouštědel a energie, což zlepšuje jak throughput, tak „greenness“ analytických postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit, zda lze ultrakrátké 2.1 x 10 mm UPLC kolony kombinované s tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií efektivně použít pro časově husté chemické stability testy. Jako modelové látky byly vybrány omeprazol (známý acidolabilní lék) a experimentální onkologický inhibitor daraxonrasib. Studie porovnávala chování těchto sloučenin při třech stress podmínkách (kyselá 0.1 N HCl, neutrální PBS, zásaditá 0.01 N NaOH) při 37 °C během 27 hodin se sledováním peak area v krátkých intervalech.

Použitá metodika a instrumentace

Analytika a příprava vzorků:

• Stock roztoky: 10 mM v 60:40 voda:acetonitril; finální koncentrace vzorků 100 µM.
• Testovací prostředí: 0.1 N HCl (acid), PBS (neutrální), 0.01 N NaOH (zásadité).
• Vzorky připraveny v triplikátu v platech QuanRecovery; analýzy probíhaly periodicky po 0, 15, 30, 45, 60 minutách a poté každou hodinu až do 27 h.

Instrumentace a chromatografické podmínky (souhrn):

• LC systém: ACQUITY Premier (Binary Solvent Manager + Column Manager) s PDA, řízení MassLynx.
• Kolona: XSelect HSS T3, 2.1 x 10 mm, 2.5 µm.
• Teplota kolony 30 °C, teplota vzorků 37 °C, injekce 1.0 µL, průtok 0.5 mL/min.
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1% formiová kyselina; B = acetonitril + 0.1% formiová kyselina.
• Gradient: 5% B (0–0.15 min), lineárně na 100% B do 0.41 min (0.26 min ramp), hold 0.06 min, reekvilibrace 0.66 min; celkem 1.25 min/run.

MS podmínky (souhrn):

• Hmotnostní spektrometr: Xevo TQ-S micro, ESI v kladném módu, detekce MRM.
• Typické nastavení: capilární napětí 3.00 kV, cone 30 V, desolvace 350 °C, desolv. plyn 1000 L/h, cone gas 10 L/h.
• Pro Daraxonrasib byly ověřeny a optimalizovány dvě MRM tranzice (jedna dříve publikovaná 811.95 -> 680.76, druhá nalezena a optimalizována manuálním laděním).

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier Binary Solvent Manager s Column Managerem a PDA detektorem.
• Kolona XSelect HSS T3, 2.1 x 10 mm, 2.5 µm.
• Xevo TQ-S micro tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr (ESI+, MRM).
• QuanRecovery 700 µL plate pro přípravu a analýzu vzorků.
• Software: MassLynx pro sběr a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Omeprazol:

• V kyselém prostředí rychlá degradace – výrazný úbytek peak area již během prvních 15 minut, pokračující pomalejší pokles během 27 h.
• Ve fyziologickém PBS pomalá a stálá ztráta signálu (<50% ztráty po 27 h).
• V zásaditém prostředí (0.01 N NaOH) byla molekula relativně stabilní po celou dobu měření.

Daraxonrasib:

• Ve všech třech testovaných podmínkách (acid, PBS, base) vykázal stabilní peak area po 27 h, bez výrazné časové degradace.
• Signál v kyselém prostředí byl vyšší než v neutrálním a zásaditém; autoři připouštějí možné vysvětlení v podobě rozdílů v ionizaci nebo aduktů v různých médiích, nikoli časové degradace.
• Optimalizovaná MRM metoda umožnila selektivní monitorování cílových iontů i při velmi krátkých dobych retence.

Diskuse:

• Ultrakrátká kolona (10 mm) s 1.25 min cyklem umožnila vysoké časové rozlišení – vhodné pro rychlé degradační kinetiky, kde delší metody mohou přehlédnout rané rychlé fáze rozkladu.
• Při použití TQ-MS je oddělení méně kritické, protože kvadrupólová MRM detekce poskytuje selektivitu pro známé analyty; to je vhodné pro screening, nikoli vždy pro komplexní identifikaci degradantů.
• Metoda šetří solvent a energii a tedy zlepšuje udržitelnost laboratorních provozů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení throughput: 1.25 min/run dovoluje ~12 injekcí za 15 minut a >1 000 injekcí za 24 h, což zrychluje screening více kandidátů nebo umožňuje lepší časové sledování degradace.
• Snížení provozních nákladů a ekologické zátěže díky nižší spotřebě organických rozpouštědel a nižší spotřebě energie.
• Vhodné pro DMPK a stability screening, kde je prioritou rychlá kvantifikace známého analytu pomocí MRM; metoda je méně vhodná, pokud je potřeba široké separace a identifikace neznámých degradantů bez další HRMS/GC-MS analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce ultrakrátkých kolon v raném screeningovém workflow, zejména ve spojení s automatizovanými 96/384-well platformami pro vysoké propustnosti.
• Integrace s automatizovanou přípravou vzorků a online vzorkovači pro kontinuální monitoring stability nebo kinetiky biotransformací.
• Vývoj škálovatějších metod pro kvantitativní přenos mezi ultrakrátkými a konvenčními kolónami, aby bylo možné snadno přejít z rychlého screeningu k hloubkové analýze degradantů.
• Využití kombinace selektivních TQ-MRM metod pro screening s následnou HRMS identifikací degradantů v případě potřeby detailní charakterizace rozkladných produktů.

Závěr

Použití ultrakrátké 2.1 x 10 mm XSelect HSS T3 kolony v kombinaci s Xevo TQ-S micro pro MRM monitoring poskytlo rychlý a robustní přístup k chemickému stability screeningu. Metoda nabídla dostatečnou citlivost a selektivitu pro kvantifikaci známých analytů při výrazně zkrácených časech analýzy, přičemž Daraxonrasib vykázal stabilitu ve všech testovaných podmínkách po 27 h, zatímco Omeprazol se rychle rozkládal v kyselém prostředí. Krátké cykly umožňují výrazné zvýšení časového rozlišení degradace a zrychlení workflow při nižších nákladech a ekologické zátěži.

Reference

1. Kerns E. High-Throughput Physicochemical Profiling for Drug Discovery. J. Pharm. Sci. 2001;90(11):1838–1858.
2. Kerns E., Di L. Pharmaceutical Profiling in Drug Discovery. Drug Discov. Today. 2003;8(7):316–323.
3. Hughes JP, Rees JP, Kalindjian SB, Philpott KL. Principles of Early Drug Discovery. Br. J. Pharmacol. 2010;162:1239–1249.
4. The Role of in vitro Testing in Drug Development. Pion Blog. Accessed 30-July-2026.
5. De Nardi C., Bonelli F. Moving from Fast to Ballistic Gradient in LC-MS/MS Pharmaceutical Bioanalysis: Matrix Effect and Chromatographic Evaluations. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006;20(18):2709–2716.
6. Dunn-Meynell K., Wainhaus S., Korfmacher W. Optimizing an Ultrafast Generic HPLC/MS/MS Method for Faster Discovery Pharmacokinetic Sample Throughput. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005;30:2905–2910.
7. Tanna N., Plummer C., Walter TH. Improved Bioanalytical Performance Using a Simplified 2-Step Oasis PRiME HLB Protocol with an Ultra-Short UPLC Column for UPLC-MS/MS. Waters App. Note. 2025.
8. Berthelette K., Collins C., Walter TH. Improving Throughput and Analytical Greenness in Pharmaceutical Discovery Using Ultrashort (2.1 x 10 mm) HPLC Columns. Waters App. Note. 2025.
9. Cregg J., et al. Discovery of Daraxonrasib (RMC-6236), A Potent and Orally Bioavailable RAS(ON) Multiselective, Noncovalent Tri-complex Inhibitor. J. Med. Chem. 2025;68(6):6064–6083.
10. El-Badry M., Taha E., Alanazi F., Alsarra I. Study of Omeprazole Stability in Aqueous Solution: Influence of Cyclodextrins. J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2009;19(5):347–351.