Aplikace metod celogenomového sekvenování v rámci monitoringu zoonotických a komenzálních bakterií izolovaných z hospodářských zvířat a potravin živočišného původu

Význam tématu

Celo-genomové sekvenování (WGS) přináší zásadní posun v monitoringu zoonotických a komenzálních bakterií z hospodářských zvířat a potravin živočišného původu. Umožňuje vysoké rozlišení typizace, sledování přenosu klonů a plazmidů, detailní identifikaci genů a mutací zodpovědných za antimikrobiální rezistenci (AMR) a lepší porovnání izolačních profilů v čase i prostoru. To posiluje schopnost včasné detekce ohnisek, mapování zdrojů kontaminace v potravinovém řetězci a informovaného rozhodování v rámci One Health přístupu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaných údajů je popsat aplikaci WGS a komplementárních metod v národním monitoringu zoonóz a AMR u izolátů ze zvířat a potravin. Dokument sumarizuje nastavené harmonizované postupy odběru, laboratorní diagnostiky, fenotypového testování (MIC) a genomové analýzy, ukazuje výsledky za sledované roky (zejména vztah genových profilů a fenotypů rezistence) a předkládá plán rozšíření sekvenační kapacity a akreditace metody do budoucna.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Sběr vzorků probíhá harmonizovaně s randomizací a stratifikací podle cílových populací; rutinní monitoring zoonóz probíhá každoročně, monitoring AMR se střídá podle typu zdroje (sudé vs. liché roky).
• Hlavní testované organismy: Salmonella spp., Campylobacter jejuni/coli, komenzální Escherichia coli, ESBL/AmpC/CPE produkující E. coli, STEC; vzorkovací schéma zahrnuje vzorky z kůže krku brojlerů, slepá střeva, výrobky z maloobchodu apod.
• Fenotypické testování rezistence: MIC testy podle evropsky harmonizovaného algoritmu, jednotné MIC desky, vyhodnocení podle ECOFF kritérií, pravidelné EQAS a akreditace metodiky.
• Genomické metody: WGS (Illumina pro krátké čtení, Oxford Nanopore pro dlouhé čtení a hybridní sestavy), standardizované WGS SOP EURL-AR, harmonizovaná QC kritéria a použití referenčních databází pro predikci rezistenčních genů a mutací.

Použitá instrumentace:

• Illumina (platforma pro krátké čtení) pro rutinní WGS.
• Oxford Nanopore (long-read) pro lepší resoluci plazmidů a složitých genomových struktur, možnost hybridních sestav.
• MALDI-TOF pro identifikaci bakteríí (např. komenzální E. coli).
• Automatizované nebo standardizované MIC desky pro fenotypické testování rezistence.
• Bioinformatické nástroje a in-house pipeline kompatibilní s CGE databázemi, ukládání dat do EFSA DB (MIC/WGS/FASTQ) a EnteroBase.

Hlavní výsledky a diskuse

- Implementace harmonizovaných postupů přinesla konzistentní datové toky MIC a WGS (~400 vzorků/rok), se záměrem navýšit kapacitu na 500–600 sekvenací/rok a rozšířit cílové organismy (STEC, kampylobaktery, MRSA plánované od 2026).
- WGS umožnilo detailní rozlišení genových profilů u ESBL/AmpC/CPE pozitivních izolátů E. coli: identifikace různých blaCTX-M variant, blaCMY-2, blaNDM-5 a chromozomových mutací spojených s rezistencí ke fluorochinolonům. Sledovány byly kombinace plazmidových a chromozomálních mechanismů rezistence a jejich časový vývoj napříč komoditami (hovězí, vepřové, drůbež).
- Detekce přenosných elementů: např. plazmid IncX3 jako nośič genu blaNDM-5, což ilustruje význam WGS pro sledování mobilních genetických elementů šířících karbapenemázy.
- Salmonella: provedeny stovky sekvenací salmonel (uvedeno období 01/2024–06/2025). Analýzy vzájemné příbuznosti odhalily klastrování kmenů (např. S. Infantis ST32) napříč regiony a výrobky, včetně spojitostí mezi jatkami, chovy a importovaným masem. Tyto výsledky dovolují identifikovat distribuční sítě a možné zdroje kontaminace (lokální i přeshraniční).
- Fenotyp vs. genotyp: porovnání relativních četností fenotypů rezistence a konkrétních genů ukazuje dynamiku změn v populacích bakterií a pomáhá vyhodnocovat účinnost intervenčních opatření a trendů v expozici rezistentním kmenům.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení pro epidemiologii: WGS umožňuje přesnou typizaci, sledování clusterů a rekonstrukci přenosových cest ve výrobním a distribučním řetězci masa.
• Sledování AMR: detekce konkrétních rezistenčních genů, plazmidů a kombinací mechanismů pomáhá cílit opatření v chovech i při zpracování potravin.
• Podpora regulatorních požadavků: kompatibilita s EFSA/EnteroBase a harmonizovanými SOP usnadňuje reportování, srovnání a účast na mezinárodních programech monitoringu.
• Veřejné zdraví a bezpečnost potravin: rychlejší a přesnější identifikace ohnisek snižuje riziko šíření a zlepšuje reakční opatření.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření sekvenační kapacity a akreditace metod umožní pravidelnou genomickou diagnostiku ve více kategoriích (např. MRSA, STEC, kampylobaktery) a stabilnější integrační toky dat pro One Health přístup.
• Využití long-read technologií a hybridních sestav pro plnou rekonstrukci plazmidů a genomových kontejnerů rezistence, což zlepší sledovatelnost přenosu mobilních elementů.
• Implementace real-time sekvenování v krizových situacích a automatizace bioinformatických pipeline pro rychlejší interpretaci výsledků.
• Zavedení robustních standardů pro datový management, interoperabilitu a sdílení dat napříč institucemi včetně širšího využití veřejných databází a EQAS schémat.

Závěr

Prezentovaná praxe ukazuje, že integrace WGS do národního monitoringu zoonóz a AMR významně zvyšuje schopnost detekce, charakterizace a sledování patogenů a rezistenčních mechanismů v potravinové produkci. Harmonizované protokoly, pravidelné EQAS a ukládání dat do mezinárodních databází jsou klíčové pro srovnatelnost dat a účinnou intervenci. Plánované navýšení kapacity, rozšíření cílových organismů a akreditace metod posílí robustnost systému a přinese přímé benefity v ochraně veřejného zdraví a bezpečnosti potravin.

Reference

• Nařízení Komise (EK) / RK 2020/1729 (uvedeno jako rámec pro monitoring AMR podle komodit a let).
• ISO 6579-1 (postupy pro izolaci a detekci Salmonella spp.).
• EURL-C (harmonizované protokoly pro Campylobacter).
• EURL-AR (SOP pro sekvenování a analýzu AMR, vč. QC kritérií).
• Databáze a repozitáře: EFSA DB (MIC/WGS/FASTQ), EnteroBase.