Unlocking the archived proteome: High-throughput, deep FFPE proteome profiling using the Orbitrap Astral mass spectrometer

Význam tématu

Formalin-fixované parafínem zalité (FFPE) tkáňové vzorky tvoří rozsáhlé klinické archivy s cennými anamnestickými daty, avšak jejich využití pro hlubokou proteomiku je komplikované fixací a křížovým vázáním proteinů. Vyvinuté rychlé a škálovatelné workflow umožňuje získat hluboký proteomický přehled z těchto archivů bez nutnosti složitého frakcionování či dlouhých chromatografických běhů, což je zásadní pro retrospektivní studie, biomarkerové projekty a translaci výzkumu do kliniky.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat zjednodušené, rychlé a robustní end-to-end workflow pro FFPE proteomiku, založené na Orbitrap Astral hmotnostním spektrometru a automatizovaném OptiSpray ionizačním zdroji, které umožní citlivou kvantifikaci proteinů při vysoké propustnosti (až 60, 180 a 500 vzorků za den). Jako model sloužily sekce normální a nádorové plicní tkáně, přičemž byla posouzena hloubka pokrytí, kvantitativní reprodukovatelnost a schopnost detekovat biologicky relevantní rozdíly.

Použitá metodika

Pracovní postup zahrnoval: rychlou deparafinizaci (xylén, gradované ethanoly), reversi formaldehydových křížových vazeb a extrakci proteinů, následnou enzymatickou digestu a čisticí kroky pomocí EasyPep Mini MS kitu. Koncentrace proteinů byla stanovena BCA testem a množství peptidů fluorometrickou peptide assay. Peptidy byly analyzovány metodou data-independent acquisition (DIA) s použitím Pulsar vyhledávače v Spectronaut (directDIA). Výstupy byly zpracovány v RStudio pro statistiku a vizualizaci.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral hmotnostní spektrometr s OptiSpray ion source (automatizovaný zdroj zajišťující čistší MS prostředí).
• LC platformy: Thermo Vanquish Neo UHPLC (přímá injekce) a Evosep Eno pro ultra-rychlé běhy.
• OptiSpray µPAC Neo kolony: 50 cm nano cartridge a high-throughput cartridge pro 20 min a 6.8 min gradienty.
• Evosep EV1182 Performance Column a Evotip Pure pro 2.3 min/500 SPD workflow.
• Spotřební materiál a činidla: EasyPep Mini MS kit, DDM (n-dodecyl ß-D-maltoside), Pierce Rapid Gold BCA, Pierce fluorometric peptide assay, LC/MS grade rozpouštědla.
• Software: Biognosys Spectronaut (directDIA), Pulsar search engine, UniProtKB/Swiss-Prot referenční databáze, R/RStudio pro další analýzy.

Hlavní výsledky a diskuse

- Workflow je kompletní do jednoho dne: ~3 h deparafinizace a extrakce, 3–4 h digest a cleanup, <25 min LC–MS běh a ~20 min automatizované zpracování dat.
- Hloubka pokrytí: při 200 ng vstupu a 20 min gradientu (60 SPD) bylo dosaženo až ~8 600 proteinových skupin a >100 000 peptidových identifikací.
- Škálování propustnosti: přechod z 60 na 180 SPD zachoval ~70 % proteinů a přechod na 500 SPD zachoval ~45 % proti 60 SPD, přičemž i při 500 SPD se stále identifikovaly tisíce proteinů. To dokládá příznivý kompromis mezi hloubkou a rychlostí analýzy.
- Nízká spotřeba vzorku: metoda vykazovala robustní výkon i při 20 ng on-column množství, což otevírá možnosti pro limitované klinické preparáty.
- Kvantitativní reprodukovatelnost: mediánové CVs proteinových abundancí byly ~5–6 % (60 SPD), ~7–10 % (180 a 500 SPD), s většinou proteinů v rozmezí CV ≤15 % i při nejrychlejších režimech.
- Biologické poznatky: při srovnání nádor vs. normál bylo identifikováno ~1 500 statisticky významně diferencovaných proteinů (|log2FC| ≥1, p ≤0,05). Enrichované dráhy zahrnovaly metabolické přeupravení (glykolýza, centrální karbonový metabolismus), HIF-1 signalizaci, remodelaci ECM, i imunitně- a fagocytózou související procesy, což odpovídá známým rysům nádorové biologie plicních karcinomů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysokopropustné proteomické profilování archivovaných FFPE vzorků s kompromisem mezi rychlostí a hloubkou, který si uživatel může volit podle potřeby. Díky nízkému požadavku na materiál a vysoké reprodukovatelnosti je vhodná pro velké kohortní studie, biomarkerové screeny, stratifikaci nádorů a retrospektivní korelace s klinickými daty. Automatizovaný ionizační zdroj snižuje znečištění MS a zvyšuje provozní robustnost při analýze velkých sérií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s posttranslačními modifikacemi: rozšíření workflow na fosfoproteomiku a další PTM analýzy přímo z FFPE materiálu.
• Standardizace a automatizace: further automatizované přípravné kroky a validované SOP pro multi-centrické studie.
• Kompatibilita s klinickými režimy: přechod k regulovaným protokolům pro použití v diagnostice a klinických studiích.
• Multimodální analýzy: kombinace s genomickými a histopatologickými daty pro hlubší fenotypizaci tumoru.

Závěr

Popsaný workflow kombinuje moderní LC–MS technologii (Orbitrap Astral + OptiSpray) se zjednodušenou přípravou FFPE vzorků a nabízí rychlé, citlivé a reprodukovatelné proteomické analýzy archivovaného materiálu. Metoda dosahuje vysoké hloubky při přijatelné ztrátě informací při zvyšování propustnosti a je robustní i pro nízké množství vstupního materiálu, což ji činí vhodnou pro translaci do studií s velkými kohortami a pro objevování biologicky relevantních rozdílů v klinických archivech.

Reference

1. Haines M. et al. High-Throughput Proteomic and Phosphoproteomic Analysis of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Molecular & Cellular Proteomics 24 (2025).
2. Zhu Y. et al. High-throughput proteomic analysis of FFPE tissue samples facilitates tumor stratification. Molecular Oncology 13, 2305–2328 (2019).
3. Wang Y. et al. Effects of tumor metabolic microenvironment on regulatory T cells. Molecular Cancer, vol. 17 (2018).
4. Liu Y., Vandekeere A., Xu M., Fendt S. M., Altea-Manzano P. Metabolite-derived protein modifications modulating oncogenic signaling. Frontiers in Oncology, vol. 12 (2022).