Ultra-high throughput proteomics at >500 samples/day using advanced Vanquish Neo UHPLC methods with Orbitrap Astral Zoom MS

Význam tématu

Růst zájmu o vysokopropustnou (high-throughput) proteomiku je hnán potřebou zpracovávat velké kohorty vzorků pro populační studie, farmaceutický screening a chemoproteomiku. Zkrácení chromatografických gradientů umožňuje dramaticky zvýšit počet analýz za den, avšak klíčovými omezeními zůstávají chromatografická stabilita, reprodukovatelnost při ultra-krátkých gradientech a schopnost hmotnostního spektrometru rychle a přesně akvizovat daty. Shrnutá studie ukazuje, jak kombinace pokročilého Vanquish Neo UHPLC a Orbitrap Astral Zoom MS posouvá praktické limity propustnosti při zachování hloubky proteomu a kvantitativní přesnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo rozšířit praktickou propustnost LC–MS pracovního postupu nad současné standardy (až na >500 vzorků/den) při zachování vysoké hloubky identifikací a reprodukovatelnosti. Autoři systematicky zkracovali délku gradientu od 3,0 do 1,0 minuty, testovali analytickou přesnost na standardizovaných HeLa digestech a ověřili robustnost za 1000 po sobě jdoucích injekcí. Dále byla ukázána aplikace workflow pro chemoproteomické obrazování cílů (ABPP) na vzorcích ze S. aureus.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: Thermo Scientific Pierce HeLa Digest Standard (řešené na 100–200 ng/µL), případně doplněné PRTC peptidy pro sledování retencí; ABPP vzorky ze S. aureus připravené podle publikované procedury.
• Separační přístup: NanoCap Trap&Elute konfigurace s krátkými gradienty 1–3 minuty; prototypová analytická kolona 150 µm × 70 mm C18 (nekomerčně dostupná) při 4 µL/min; trap kolona PepMap Neo 300 µm × 5 mm; EASY-Spray emitter 15 µm ID (ES994) a ve srovnávacích bězích kolona 150 µm × 150 mm (ES906).
• Akvizice: Data-independent acquisition (DIA) s 4 Th okny a nastaveným maximálním MS2 injekčním časem 3 ms pro dosažení ~3–4 MS2 datových bodů na peak při daných gradientech; Orbitrap plný scan v rozlišení 240k; scan range typicky 400–800 m/z (konfigurovatelné dle potřeby).
• Parametry MS (klíčové z Tab.1): Orbitrap rozlišení 240k, AGC target 500%, MS2 max. inj. čas 3 ms, NCE 25, okna DIA 3–5 Th (nastavitelné podle gradientu a požadovaných DPPP).
• Software pro zpracování: Spectronaut 20.5, Proteome Discoverer 3.3 SP1 s CHIMERYS 5.0 a DIA-NN Enterprise 2.3.2; vyhledávání proti SwissProt Homo sapiens databázi.

Hlavní výsledky a diskuse

Výkon a identifikace:

• Při 500 SPD (gradient ~1,7 min) bylo dosaženo přibližně 5 600–6 600 proteinových skupin (54–68 tisíc peptidů) v triplikátech; při 600 SPD (gradient ~1,2 min) přibližně 5 300–5 900 skupin (46–52 tisíc peptidů). Výsledky byly konzistentní mezi Spectronaut a zpracováním v Proteome Discoverer s CHIMERYS/DIA-NN.
• Snížení délky gradientu má jen omezený vliv na celkový počet identifikací až do ~1,6 min, poté počet identifikací začíná klesat rychleji. To souvisí s relativním zúžením okna elučních peptidů vzhledem k konstantnímu zpoždění prvních elujících složek.

Kvantitativní přesnost a MS2 datové body:

• MS2 datových bodů na peak (DPPP) korelují lineárně s délkou gradientu a s nastavením DIA cyklu (v této studii ~320 ms pro pokrytí 80 DIA oken). S 3 ms max. MS2 injekčním časem byly mediány MS2 DPPP ~3–4.
• Kvantitativní přesnost byla vynikající: medián CV na úrovni proteinových skupin 6,7–4,6 % a medián peptide-level CV 12,5–9,2 % v závislosti na throughputu.

Robustnost:

• Po 1000 po sobě jdoucích injekcích 50 ng HeLa při 600 SPD nebyl zjištěn systematický drift v počtu identifikovaných proteinových skupin ani v retenčních časech PRTC peptidů; celkový CV retencí ~1,7 %, což indikuje vysokou stabilitu Vanquish Neo při ultra-krátkých gradientech a zvýšených průtocích.

Aplikace na chemoproteomiku (ABPP):

• Ultra-rychlé metody zachovávají schopnost detekovat obohacené cílové proteiny malého antibiotického ligandu v S. aureus. Ačkoli celková proteomová pokrytí mírně klesá s rostoucím throughputem, klíčové obohacené proteiny a jejich relativní fold-change byly dobře zachovány i při 500 SPD.

Přínosy a praktické využití metody

Klíčové přínosy:

• Výrazné zvýšení propustnosti: rozšíření z běžných ~300 SPD až na 500–600 SPD bez zásadního kompromisu v kvalitě dat.
• Vysoká kvantitativní přesnost a reprodukovatelnost vhodná pro screeningové aplikace, large-cohort studie a rychlé validace cílových proteinů.
• Snížení času a nákladů na analýzu na vzorek, což usnadňuje škálování studií a zrychluje rozhodovací proces ve výzkumu a vývoji.

Praktické využití:

• Vysokopropustné farmaceutické a toxikologické screeny.
• Population-scale proteomics pro biomarkerové studie.
• Rychlé chemoproteomické screeny pro identifikaci proteinových cílů malých molekul.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Další optimalizace kombinace kolona/flow/configurace trap-and-elute a softwarových cyklů pro snížení LC duty cycle a zvýšení SPI (samples per instrument) bez ztráty kvality.
• Vylepšení MS metodiky (např. adaptivní DIA okna, dynamické přidělování injekčních časů) pro zvýšení MS2 DPPP i při ultra-krátkých gradientech.
• Rozšíření nasazení na klinické kohorty a multi-omics integrace, kde je kritická rychlost zpracování velkých souborů dat.
• Automatizace přípravy vzorků a robustní QA/QC pipelines pro průmyslovou implementaci.

Závěr

Kombinace Vanquish Neo UHPLC v NanoCap Trap&Elute režimu a Orbitrap Astral Zoom MS demonstruje možnost posunout praktickou propustnost proteomických analýz nad 500 vzorků/den s udržením vysoké hloubky identifikací, kvantitativní přesnosti a dlouhodobé robustnosti. Workflow je použitelný pro rychlé screeny v chemoproteomice i pro velké kohortní studie, přičemž další optimalizace MS metod a LC komponent může tento výkon dále zvyšovat.

Reference

1. Mostert et al., Chemical Science, 2025, 16, 9472-9483.
2. Thermo Fisher Scientific, Technical Note TN003939 – High-throughput proteomics using narrow window DIA on the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer.