Rapid LC-UV/MS Workflow for Routine Oligonucleotide Impurity Monitoring Using the SQ Detector 2 Mass Detector and Empower™ Chromatography Data System (CDS)

Význam tématu

Analytika antisense oligonukleotidů (ASO) je kritická pro zajištění bezpečnosti a účinnosti těchto léčiv. ASO syntetizované fosforamiditovou cestou vytvářejí komplexní směsi obsahující plnou délku produktu (FLP), trunky, kapované sekvence a modifikační nesprávnosti, které se liší jen o jednotku nukleotidu nebo drobnou chemickou změnu. Rychlé, přesné a auditovatelné metody pro rutinní monitorování nečistot v kontrolovaných prostředích zkracují dobu uvolnění šarží a snižují riziko chyb závislých na analytikovi.

Cíle a přehled studie / článku

Studie předkládá zkrácený IP-RP-UPLC-LC-UV/MS pracovní postup pro rutinní QC monitorování lipid-konjugovaného ASO a souvisejících nečistot. Cílem bylo ukázat, že 6,5minutová chromatografie v kombinaci s Tunable UV detekcí, SQ Detector 2 a Empower CDS poskytuje:

• robustní kvantitativní UV výsledky s masově založenou identifikací,
• selektivní vyhodnocení spolueelujících složek pomocí XIC,
• kompatibilitu s regulovaným prostředím díky auditovatelnému workflow v Empower CDS,
• vyšší průchodnost, nižší spotřebu vzorku a reagencií.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala rychlý IP-RP-UPLC separační způsob s inline TUV (260 nm) a paralelní MS detekcí (negativní ESI). Pro validaci pracovního postupu byly analyzovány standardní a nuceně degradované vzorky (oxidativní 0,03 % H2O2 2 h; termální 60 °C 2 h).

Klíčové instrumentální a provozní parametry:

• LC systém: ACQUITY UPLC I-Class (ACQUITY Premier komponenty),
• Kolona: ACQUITY Premier Oligonucleotide C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 x 50 mm, teplota 50 °C, průtok 0.52 mL/min, doba analýzy 6.5 min, injekční objemy 1.6–4.8 µL, teplota vzorku 5 °C,
• Detektory: Tunable UV (TUV) jako primární kvantitace; SQ Detector 2 pro jednotkovou (nominal) hmotnost a XIC selektivitu,
• Ionizace: ESI-, kapilární napětí ~2.2 kV, desolvace 450–600 °C, zdroj 120–150 °C,
• Vials a povrchy: QuanRecovery Vials s MaxPeak HPS, MaxPeak Premier HPS povrchy v LC cestě a kolonce pro snížení adsorpce,
• Mobilní fáze: ion-pairing (tributylaminát, 5 mM TBuAA) s EDTA 1 µM; fáze A: 10 % ACN; fáze B: 80 % ACN,
• Software: Empower 3.8.1 pro řízené získávání dat, zpracování, audit trail a reporting.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění a způsoby zpracování dat:

• 6,5minutová metoda dosahuje srovnatelné separace a citlivosti jako delší UHPLC postupy, přičemž spotřebuje přes 5× méně vzorku na injekci a výrazně méně mobilní fáze a ion-pair reagentu, čímž zvyšuje průchodnost a ekologickou efektivitu.
• Primární kvantitace probíhá z UV signálu po blank-subtrakci mobilní fáze; UV je méně zatíženo ionizačními variabilitami než MS a slouží pro robustní assay.
• MS (SQ Detector 2) poskytuje nominální hmotnostní informace a XIC kanály pro FLP a blízké varianty (např. FLP (P = O) rozdíl ~16 Da, tedy ~4 m/z při náboji -4), což umožňuje rozdělení UV plochy mezi spolueelující se komponenty a korekci reportované purity.
• Porovnání „standard“ vs. „harsh“ ionizačních podmínek pomáhá rozlišit labile addukty od kovalentních/neodstranitelných produktových variant; signály s výrazným úbytkem za „harsh“ podmínek jsou klasifikovány jako addukty.
• Kalibrace: UV linearita je zajištěna lineárním vztahem oblasti UV vs. množství na kolonce; MS signál vykazuje nelineární chování, proto byla použitá kvadratická kalibrace pro součet XIC FLP+FLP(P=O). Kvadratické koeficienty jsou integrovány do výpočtů v Empoweru.
• Zpracování v Empower: sekvence obsahuje blanky pro odečtení pozadí, automatické i ručně ověřené integrační hranice (vč. určení koncového bodu hlavního UV píku na základě pozice nejpozději elujících MS komponent) a generování audit-ready reportů.

Přínosy a praktické využití metody

Přínosy metody pro rutinní QC a průmyslové použití:

• Zrychlení zpracování a vyšší vzorková propustnost – kratší doba běhu a zjednodušené zpracování s předdefinovanými šablonami v Empoweru umožňují rychlejší rozhodování o uvolnění šarží.
• Snížení spotřeby vzorků a reagentů – úspora standardního materiálu a méně škodlivých chemikálií v mobilních fázích.
• Vyváženost kvantifikace a identifikace – zachování robustní UV kvantifikace doplněné MS apportionmentem spolueelujících nečistot zvyšuje přesnost reportované purity.
• Snížení adsorpce a ztrát analyzátu díky MaxPeak HPS povrchům napříč LC cestou, kolonkou a vialy zlepšuje limity detekce a obnovitelnost.
• Auditabilita a compliance – kontrolovaný přístup, audit trail a elektronické podpisy v Empower CDS podporují nasazení v regulovaném QC prostředí (např. 21 CFR Part 11).

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a aplikací:

• Větší automatizace a integrace: širší využití přednastavených procesních šablon, automatické aplikace MS-korekce UV hranic a plně automatizované reportování pro snížení lidského zásahu.
• Přenos poznatků z HRMS: počáteční charakterizace na vysokorozlišovacích systémech (např. BioAccord) a následné routinní přenesení cílových hmotností do SQ workflow pro provozní šetření nákladů.
• Ekologičtější chromatografie: další optimalizace mobilní fáze a snížení používání ion-pair reagentů; kratší metody a menší spotřeba kapalných organických rozpouštědel.
• Lepší materiály a povrchy: rozvoj nízkoadsorpčních materiálů a pokročilých povrchových úprav pro ještě vyšší recovery a nižší interakce oligonukleotidů s kovovými částmi přístrojů.
• Pokročilé zpracování dat: aplikace strojového učení pro rozpoznání aduktů vs. produktových variant a pro prediktivní nastavení integračních parametrů.

Závěr

Popisovaný LC-UV/MS pracovní postup kombinuje rychlou (6,5 min) IP-RP-UPLC separaci, robustní UV kvantifikaci, nominelní masovou identifikaci pomocí SQ Detector 2 a auditovatelnou správu dat v Empower CDS. Workflow efektivně propojuje detailní charakterizaci získanou na HRMS s rutinními, cílenými kontrolami na SQ úrovni, čímž zkracuje čas od vzorku k výsledku, zvyšuje průchodnost laboratoře a podporuje konzistentní rozhodování v regulovaných QC laboratořích. MaxPeak HPS povrchy výrazně snižují problémy s adsorpcí oligonukleotidů a zlepšují obnovu na stopových úrovních nečistot.

Reference

1. Capaldi D; et al. (2017) Impurities in oligonucleotide drug substances and drug products. Nucleic Acid Therapeutics, 27(6):309–322. doi:10.1089/nat.2017.0691.
2. Obexer R; et al. (2024) Modern approaches to therapeutic oligonucleotide manufacturing. Science, 385, eadl4015. doi:10.1126/science.adl4015.
3. Rentel C; et al. Method referenced in: Agilent Technologies (2026) Determination of Purity, Assay, and Impurity Profile for a Ligand-Conjugated Antisense Oligonucleotide Using Agilent Oligo Analysis Accelerator for OpenLab CDS. Agilent Application Note 5994-7993EN.
4. Elmekawy A; et al. (2025) At-line analysis of antisense oligonucleotide purified fractions using fast chromatographic methods. Journal of Chromatography A, 1764, 466516. doi:10.1016/j.chroma.2025.466516.