Chlorophyll Quantitative Measurement: Using Equations from Japanese Water Standard Test Methods

Shrnutí: Kvantitativní stanovení chlorofylu pomocí UV-VIS a konfigurace výpočtů v LabSolutions UV-Vis

Význam tématu

Stanovení chlorofylu v povrchových a užitkových vodách je důležité pro hodnocení eutrofizace, biologické kvality a přítomnosti řasových květů. Rychlé a spolehlivé spektrofotometrické metody umožňují rutinní monitorování a podporují rozhodování v oblasti úpravy vody a ochrany zdrojů. Integrace komplexních výpočtů přímo do řídícího softwaru snižuje manuální zásahy, riziko chyb a zrychluje zpracování výsledků a přípravu zpráv.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje aplikaci nové verze softwaru LabSolutions UV-Vis (Ver. 1.21) pro přímé vyhodnocení koncentrací chlorofylů (a, b, c) a karotenoidů podle Japonských vodních standardů (Water Standard Test Methods III: Organic Materials). Cílem bylo ukázat: jak nastavit složité vzorce v softwaru, jak zpracovat extrakty (acetone/ethanol) a jaké výsledky lze očekávat pro reálné vzorky (městská voda, veřejná fontána, extrakt z listu zelí).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika (stručně):

• Vzorky: městská voda z budovy, voda z parkové fontány, extrakt z vnějšího listu zelí (cca 0,1 g).
• Acetonová extrakce: úprava vzorku MgCO3 (1 mL suspenze na 1 L vody), filtrace přes skleněné vlákno, mechanické rozemletí filtru v malém množství acetonu, doplnění acetonu na celkem 12 mL, stání v chladu a temnu 1 h, centrifugace ≈1500 g 10 min, použití 10 mL supernatantu jako měřeného roztoku.
• Ethanolová extrakce: filtrace 1 L vody přes skleněné vlákno, nasákání filtru ethanolem (20–25 mL), ohřev 75 °C 5 min, ochlazení, centrifugace, použití supernatantu.
• Pro ethanolový postup navíc acidifikace části extraktu HCl (3 mol/L) a měření před a po acidifikaci.

Instrumentace a provozní podmínky (uvedeno):

• Spektrofotometr: Shimadzu UV-1900i Plus.
• Řídící software: LabSolutions UV-Vis Ver. 1.21.
• Optika: štěrbina 1 nm, fotometrická režim absorbance.
• Fotometrické vlnové délky (acetone): 480, 630, 645, 663 a 750 nm; integrace 1 s.
• Spectrální režim (acetone): 400–760 nm, nízká rychlost skenování.
• Fotometrické vlnové délky (ethanol): 665 a 750 nm; spektrální rozsah 600–800 nm.

Konfigurace výpočtů v LabSolutions UV-Vis

LabSolutions UV-Vis Ver. 1.21 umožňuje vytvořit složité vzorce pro přepočet absorbancí na koncentrace a přidat do výsledkové tabulky sloupce pro objem extraktu, objem filtrované vody a další mezivýpočty. Podporovány jsou rozšířené matematické funkce a možnost odkazovat na hodnoty z jiných řádků (např. rozdíl absorbancí před/po acidifikaci). To eliminuje manuální přepis dat do tabulek a snižuje chybovost.

Hlavní výpočty použitých rovnic (shrnutí)

- Chlorofyl a (acetone): kombinace korelovaných absorbancí po odčtení absorbance při 750 nm, s koeficienty pro 663, 645 a 630 nm; výsledná hodnota se násobí poměrem objemu extraktu k objemu vzorku a 1000 pro převod na µg/L.
- Karotenoidy: vypočteny z diference 480 nm (po odečtení 750 nm) s faktorovou konverzí odlišnou podle typu řas (zelené nebo diatomy).
- Chlorofyl b a c (acetone): lineární kombinace e663, e645 a e630 s příslušnými koeficienty uvedenými ve standardech.
- Chlorofyl a (ethanol): spočten jako rozdíl absorbancí před a po acidifikaci (A − Aα) krát konstanta 29.6, násobená poměrem objemu extraktu k objemu vzorku a zohledněním délky optické dráhy cuvety.

Poznámka: v softwaru byly tyto vzorce implementovány do formulářového okna, kde lze rovnou zadávat objemy a mezivýpočty pro jednotlivé řádky výsledné tabulky.

Hlavní výsledky a diskuse

- Pro testované vzorky z veřejných vod (městská budova, parková fontána) nebyl detekován chlorofyl a ani v acetone ani v ethanolových extraktech nad pozadím, což indikuje nízké hladiny řasových biomarkerů v těchto vodách.
- Extrakt z listu zelí vykázal výrazný absorpční pás při ~663–665 nm; podle použitých vzorců bylo možné stanovit koncentraci chlorofylu a. Acidifikace ethanolového extraktu vedla k příslušnému poklesu absorbance, který se využil ve výpočtu.
- Implementace vzorců přímo v LabSolutions odstranitla potřebu přepisovat data do externích tabulek a umožnila zadávání individuálních parametrů (objemy, délky dráhy, mezihodnoty) pro každý vzorek.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé zpracování výsledků v laboratořích monitorujících kvalitu vody s menší chybovostí díky automatizovaným výpočtům v softwaru.
• Možnost zpracovat více typů extrakcí (acetone i ethanol) a spočítat různé frakce chlorofylů a karotenoidů v jednom softwarovém prostředí.
• Užitečné pro environmentální monitorování, výzkum primární produkce a kontrolu zdrojů pitné vody.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace pracovních postupů: integrace předzpracování dat (např. korekce blanku, automatické rozpoznání šumu) a rozšíření podpory pro více typů buněk a filtrů.
• Propojení softwaru s LIMS a reportovacími nástroji pro automatické generování certifikovaných protokolů a sledovatelnost dat.
• Použití pokročilých algoritmů (např. multivariabilní kalibrace, strojové učení) pro zlepšení rozlišení mezi různými biomarkerovými signály v komplexních maticích vody.
• Rozšíření validace metody pro nižší hranice detekce a pro různé druhy vod (povrchové, pitné, odpadní) v souladu s národními a mezinárodními standardy.

Závěr

LabSolutions UV-Vis Ver. 1.21 ve spojení se spektrofotometrem UV-1900i Plus umožňuje efektivní implementaci složitých výpočtů potřebných pro stanovení chlorofylů podle japonských vodních standardů. Metoda zjednodušuje workflow, snižuje manuální zásahy a je vhodná pro rutinní environmentální a vodohospodářské analýzy. Demonstrace na reálných vzorcích potvrdila použitelnost postupu pro identifikaci a kvantifikaci chlorofylu v koncentrovaných extraktech.

Použitá instrumentace

• Spektrofotometr: Shimadzu UV-1900i Plus.
• Software: LabSolutions UV-Vis Ver. 1.21 (nové možnosti pro vkládání sloupců s objemy a mezihodnotami, rozšířené matematické funkce).
• Další spotřební materiál: 10 mm absorpční kyvety, filtry ze skleněných vláken, centrifuga, vodní lázeň.

Reference

1. Water Standard Test Methods 2020 Edition III: Organic Materials, Japan Water Works Association.
2. Application News No. A631: Quantitative Analysis of Chlorophyll a, b and Carotenoids in Cabbage — Use of Evaluation Function of LabSolutions UV-Vis.