Accelerating Confident Unknown Identification Using Agilent Revident LC/Q-TOF and MassHunter Explorer 2.0

Význam tématu

Monitoring kvality vody vyžaduje širší přístup než klasické cílené analýzy, protože cílené metody postihují pouze předem definované látky a mohou opomíjet nové nebo transformační produkty. Nekontrolované (non-targeted) přístupy založené na vysokém rozlišení hmotnostní spektrometrie (HRMS) umožňují komplexní prohledání chemického prostoru, ale generují velké množství signálů, z nichž většina jsou šumy, matrice nebo artefakty. Studie ukazuje, jak integrovaný workflow kombinuje LC/Q-TOF akvizici s chemometrickými filtry a nástroji pro identifikaci struktur (SIRIUS/CSI:FingerID) za účelem efektivního a spolehlivého zjišťování neznámých kontaminantů ve vzorcích vody.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat praktický a škálovatelný postup pro identifikaci neznámých organických znečišťujících látek ve vodních vzorcích pomocí Agilent Revident LC/Q-TOF a softwaru MassHunter Explorer 2.0. Studie použila fortifikovaný vzorek vody a kontrolu pro ukázku workflow zahrnující: extrakci prvků (feature extraction), komparaci BPC (base peak chromatogram), chemometrické filtrování (fold change), porovnání s více spektrálními databázemi (PCDL) a nezávislé potvrzení putativních identifikací pomocí SIRIUS/CSI:FingerID.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinovala UHPLC separaci s vysokorozlišenou Q-TOF hmotovou spektrometrií a následným softwarem pro zpracování dat. Klíčové prvky postupu:

• Příprava: fortifikovaný vzorek vody a odpovídající kontrola, vzorky bez další přípravy, injekce 20 µL.
• Chromatografie: Altura ZORBAX Eclipse Plus C18, 2.1 × 100 mm, 1.8 µm; mobilní fáze A: 10 mM ammonium formiát pH 5, B: 10 mM ammonium formiát pH 5 v methanolu; průtok 0.45 mL/min; teplota kolony 45 °C; gradient od 2 % B do 99 % B podle zkušebního programu.
• MS akvizice: pozitivní režim, m/z 50–500, MS akviziční rychlost 3 spektra/s (plný scan), řízené MS/MS (directed) s izolací ~1.3 m/z, fixní kolizní energie 40 eV, prahové hodnoty a tolerance nastavené pro získání kvalitních MS/MS spekter.
• Softwarové zpracování: MassHunter Acquisition 12.1, Qualitative Analysis 12.0 upd1 pro BPC, MassHunter Explorer 2.0 pro extrakci/zarovnání, chemometrii a párování s PCDL knihovnami. Dále Agilent ChemVista pro správu PCDL a SIRIUS/CSI:FingerID pro predikci sumárních vzorců a návrh struktur.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Agilent 1290 Infinity III systémy (High-Speed Pump G7120A, Multisampler G7167B, Multicolumn Thermostat G7116B, InfinityLab Assist Hub G7180A).
• Kolona: Altura ZORBAX Eclipse Plus C18, 2.1 × 100 mm, 1.8 µm.
• MS: Agilent Revident Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (model G6575A).
• Ionizace: Agilent Dual Spray Jet Stream Technology Ion Source (AJS, G1959A).
• Software: MassHunter Acquisition 12.1, MassHunter Qualitative Analysis 12.0 upd1, MassHunter Explorer 2.0, Agilent ChemVista, SIRIUS/CSI:FingerID.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění:

• Detekce: v BPC fortifikovaného vzorku bylo patrných 20 odlišných píků oproti kontrole.
• Feature extraction: celkem bylo extrahováno 528 feature; aplikací fold change filtru (FC > 10) vůči kontrole se počet kandidátů snížil na 51, tj. >90% redukce datového šumu.
• Identifikace: ze 20 BPC píků bylo 17 putativně identifikováno jako pesticidy párováním MS/MS do Agilent PCDL databází (pesticides, EPA1699, E&L, MoNA). Všechny identifikované pesticidy vykázaly vynikající hmotnostní přesnost pod 1 ppm a MS/MS skóre >81.
• Potvrzení struktur: putativní zápasy byly ověřeny pomocí SIRIUS/CSI:FingerID, které potvrdilo sumární vzorce a navrhlo struktury na základě fragmentačních vzorů a kruhového hodnocení kandidátů; SIRIUS také pomohl odstranit falešné pozitivy.
• Falešné pozitivy: čtyři píků (označené 1, 3, 4, 7) vykazovaly rozdíly v intenzitě BPC, ale nebyly unikátními feature mezi vzorkem a kontrolou a SIRIUS potvrdil, že se nejedná o shodu — tyto byly vyřazeny.
• Isomerní diferenciace: dvě strukturální isomery (sebuthylazin a terbuthylazin, m/z 230.1167) byly rozlišeny pouze podle retenčního času (9.12 vs 9.35 min), protože jejich MS/MS spektra byla téměř identická.
• Rozsah detekce: celkem bylo detekováno 20 pesticidů (zejména organické pesticidy a některé halogenované látky), část z nich byla detekována i v negativním režimu; citlivost při injekci 20 µL pokrývala rozsah signálů od stovek tisíc do milionů počtů.

Přínosy a praktické využití metody

Významné praktické přínosy workflow:

• Výrazné snížení pracovního zatížení: automatizace extrakce a filtrace snižuje potřebu manuálního vybírání píků a ručního vyhodnocování.
• Zvýšená spolehlivost: kombinace chemometrického filtrování, kvalitní MS/MS shody a strojově učeného potvrzení (SIRIUS) snižuje riziko falešných pozitiv a zvyšuje důvěru v přiřazení struktur.
• Široká uplatnitelnost: metoda je využitelná pro environmentální monitorování, kontrolu bezpečnosti potravin, screening reziduí pesticidů a v biomarkerových studiích.
• Škálovatelnost a opakovatelnost: projektově orientované softwarové prostředí (MassHunter Explorer) umožňuje iterativní doplňování dat a opakované zpracování se zachováním reprodutovatelnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a rozšíření přístupu:

• Hlubší integrace strojového učení pro prioritizaci kandidátů a predikci fragmentace.
• Rozšíření a sjednocení spektrálních a strukturálních databází (větší pokrytí pojmenovaných i podezřelých látek) pro lepší škálovatelnost suspect-screeningu.
• Automatizace kvantitativní fáze: integrace semi- nebo plně kvantitativních postupů do non-targeted workflow pro rychlé posouzení expozičního rizika.
• Vícepolární akvizice a hybridní instrumentace (kombinace HRMS s ion mobility, tandemní techniky) pro lepší diferenciaci izomerů a izobarů.
• Standardizace postupů a validace workflow pro regulatorní účely a mezilaboratorní srovnatelnost.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace Agilent Revident LC/Q-TOF, projektově orientovaného softwaru MassHunter Explorer 2.0, chemometrického filtrování a SIRIUS/CSI:FingerID poskytuje účinný a spolehlivý postup pro identifikaci neznámých organických kontaminantů ve vodních vzorcích. Workflow umožnilo redukci datového šumu o více než 90 %, zefektivnění pracovního procesu a potvrzení 20 pesticidů s velmi dobrou hmotnostní přesností (< 1 ppm). Díky těmto vlastnostem je postup vhodný pro rutinní screening v oblasti ochrany životního prostředí, potravinové bezpečnosti i výzkumných aplikací.

Reference

1. Nieto S.; Chen K.; Alaimo C.; Young T. Comprehensive Profiling of Environmental Contaminants in Surface Water Using High-Resolution GC/Q-TOF. Agilent Technologies application note, publication number 5994-1371EN, 2019.
2. Sartain M.; Bertram L.; McEachran A.; Pyke J.; Hoffmann M. A. Drug Metabolite Identification with a Streamlined Software Workflow: Combining Agilent Revident Q-TOF LC/MS and MassHunter Explorer 2.0. Agilent Technologies application note, publication number 5994-8867EN, 2026.
3. Dührkop K.; Fleischauer M.; Ludwig M.; Aksenov A. A.; Melnik A. V.; Meusel M.; Dorrestein P. C.; Rousu J.; Böcker S. SIRIUS 4: A Rapid Tool for Turning Tandem Mass Spectra into Metabolite Structure Information. Nature Methods 2019, 16(4), 299–302. DOI: 10.1038/s41592-019-0344-8.
4. Dührkop K.; Shen H.; Meusel M.; Rousu J.; Böcker S. Searching Molecular Structure Databases with Tandem Mass Spectra Using CSI:FingerID. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 2015, 112(41), 12580–12585. DOI: 10.1073/pnas.1509788112.
5. Kornas P.; Chadha M. Quantitation of 764 Pesticide Residues in Tomato by LC/MS According to SANTE 11312/2021 Guidelines. Agilent Technologies application note, publication number 5994-5847EN, 2023.