Drug Metabolite Identification with a Streamlined Software Workflow

Význam tématu

Metabolitická identifikace léčiv je klíčová pro pochopení farmakokinetiky, bezpečnosti a interakcí nových sloučenin.
Absence referenčních spekter biotransformačních produktů ztěžuje jejich detekci zejména v rané fázi vývoje, kde chybí tradiční knihovny.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vytvořit efektivní workflow spojující vysoce rozlišenou LC/Q-TOF hmotnostní spektrometrii, chemometrickou analýzu a prediktivní strukturální identifikaci.
Jako modelová látka byl použit verapamil, inkubovaný s lidskými mikrozomy pro simulaci metabolismu, následně analyzován statistickými filtry a strukturálními nástroji.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky verapamilu byly inkubovány v 96-jamkové destičce s mikrozomy při 37 °C, reakce byla zastavena aketonitrilem a proteiny sráženy.
Přímá injekce supernatantů byla realizována pomocí Agilent 1260 Infinity III hybridního multisampleru v režimu Feed Injection.
Chromatografie probíhala na Agilent Infinity III LC se sloupci Poroshell 120 EC-C18; mobilní fáze tvořil roztok amonium formiátu a methanol, gradient trval 12,5 min.
Hmotnostní spektrometrie využila přístroj Agilent Revident Q-TOF LC/MS s technologií Dual Jet Stream v pozitivním módu pro MS a řízené MS/MS.
Chemometrickou extrakci a statistické vyhodnocení zajistil Agilent MassHunter Explorer 2.0, strukturální elucidaci pak SIRIUS se CSI:FingerID a vlastním BioTransformer databázovým modulem.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný režim Feed Injection významně zlepšil chromatografické tvary a umožnil přímé injekce bez koncentračních kroků.
Chemometrickou filtrací bylo z 7 501 extrahovaných objektů vybráno 88 signifikantních funkcí spojených s verapamilem.
Řízeným MS/MS záznamem získané fragmentační spektra umožnily vysoce čisté MS/MS analýzy.
Spektrální vyhledávání v PCDL identifikovalo známé metabolity jako verapamil, norverapamil, D-617 a D-620.
SIRIUS se CSI:FingerID a BioTransformer předpověděl a identifikoval 27 metabolitů (fáze I), včetně izomerů a méně běžných biotransformačních produktů.
Komparace retenčních časů s autentickými standardy potvrdila identifikace norverapamilu, p-O-desmethylverapamilu, PR-25 a dalších.
Mapování identifikovaných struktur zpět do MassHunter Explorer umožnilo vizualizaci kinetiky formování metabolitů a validaci metabolických drah.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminuje potřebu složité přípravy vzorků díky přímé injekci s feed injection.
• Umožňuje současnou detekci známých i nových metabolitů pomocí integrovaného software.
• Škálovatelný přístup vhodný pro rané fáze vývoje léčiv a profilování xenobiotik.
• Zvýšená citlivost a spolehlivost detekce podporují kvantitativní i kvalitativní studie metabolismu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj umělé inteligence pro pokročilé predikce metabolismu a real-time data processing.
Rozšíření custom databází o fázi II metabolismu a interakce s mikrobiomem.
Integrace multi-omics přístupů a on-line platformy pro automatizované reporty metabolitů.

Závěr

Navržené workflow efektivně kombinuje high-resolution LC/Q-TOF MS, chemometrickou filtraci a strojově učení založenou strukturální elucidaci.
Metoda prokázala schopnost detekovat a identifikovat široké spektrum verapamilových metabolitů bez nutnosti rozsáhlých referenčních knihoven.
Přístup nabízí univerzální platformu pro komplexní metabolitické studie v oblasti farmaceutického výzkumu.

Reference

1. Herschbach H. et al. Performance Characteristics of the Agilent 1260 Infinity II Hybrid Multisampler. Agilent Techn. Overview 2023.
2. Naegele E. Improved Peak Shape and Lower LOQs in Pesticide Analysis. Agilent Techn. App. Note 2024.
3. Dührkop K. et al. SIRIUS 4: A Rapid Tool for Turning Tandem Mass Spectra into Metabolite Structure Information. Nat. Methods 2019;16(4):299–302.
4. Dührkop K. et al. Searching Molecular Structure Databases with Tandem Mass Spectra Using CSI:FingerID. PNAS 2015;112(41):12580–12585.
5. Wishart DS. et al. BioTransformer 3.0—A Web Server for Accurately Predicting Metabolic Transformation Products. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W115–W123.
6. Djoumbou-Feunang Y. et al. BioTransformer: A Comprehensive Computational Tool for Small Molecule Metabolism Prediction and Metabolite Identification. J. Cheminf. 2019;11(1):2.