An End-to-End Untargeted LC/MS Workflow for Metabolomics and Lipidomics

Význam tématu

Untargeted metabolomika a lipidomika pomocí LC/MS představují klíčové objevné přístupy pro pochopení biochemie a fyziologie komplexních vzorků. Přístup vyžaduje robustní workflows umožňující spolehlivou identifikaci stovek až tisíců sloučenin s vysokou přesností a reprodukovatelností metod.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace je představit ucelený end-to-end untargeted workflow pro metabolomiku i lipidomiku na stejných vzorcích plazmy či buněčných extraktů. Klíčové kroky zahrnují automatizovanou přípravu vzorku, frakcionaci, chromatografickou separaci, vysoce citlivou detekci a pokročilou datovou analýzu včetně identifikace neznámých sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizovaná příprava vzorků: Bravo Metabolomics Sample Prep Platform spojena s Captiva EMR–Lipid Plate pro oddělení polarních metabolitů, lipidů a proteinů.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II/III bio LC s InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolonnou (2,1×150 mm, 2,7 µm, 24 min) pro metabolity a ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 kolonnou (2,1×100 mm, 1,8 µm, 16 min) pro lipidy.
• Detekce: Agilent Revident Q-TOF LC/MS zajišťuje vysoké rozlišení, isotopickou věrnost, hmotnostní přesnost <1 ppm a široký dynamický rozsah.
• Akvizice dat: MS1 analýza v pozitivním a negativním módu s volitelnou iterativní Auto MS/MS akvizicí pro obohacení spektra nízkoabundantních analyz.
• Softwarová analýza: tvorba a správa PCDL databází v Agilent ChemVista; extrakce funkcí, normalizace a statistika v MassHunter Explorer; extrakce MS/MS dat a tvorba vlastních knihoven v MassHunter Qualitative Analysis a Lipid Annotator; identifikace neznámých funkcí pomocí SIRIUS s CSI:FingerID.

Hlavní výsledky a diskuse

• Automatizace přípravy snížila variabilitu vzorků až o 50 % a zlepšila koeficienty variační.
• Revident Q-TOF udržel hmotnostní přesnost pod ±1 ppm po více než 200 injekcích a prokázal vysokou isotopickou fidelitu i při saturaci signálu.
• Použití vlastních databází z iterativního MS/MS vedlo k identifikaci stovek metabolitů a lipidů (>10 000 funkcí, z nich 414 pozitivních a 336 negativních metabolitů, 612 lipidů významně odlišných mezi skupinami).
• SIRIUS s CSI:FingerID doplnil workflow o návrhy struktur pro dosud neidentifikované funkce a umožnil další potvrzení ve veřejných databázích.

Přínosy a praktické využití metody

• Modulární end-to-end řešení urychluje zavedení omics analýz v laboratořích bez nutnosti rozsáhlého nastavování.
• Možnost analýzy metabolitů i lipidů ze stejného vzorku šetří cenný biologický materiál a umožňuje integrované biologické interpretace.
• Vysoce reprodukovatelné a standardizované metody zajišťují důvěryhodnost výsledků pro výzkum i QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s nejnovějšími generacemi LC systémů (Infinity III) a vysokopropustné formáty analýz.
• Rozšiřování spektrálních knihoven díky spolupráci a sdílení dat v open-source komunitách.
• Využití umělé inteligence a strojového učení pro automatickou interpretaci MS/MS spektroskopie a predikci struktur neznámých analyz.
• Pokročilá multi-omics integrace kombinující proteomiku, metabolomiku a lipidomiku pro komplexní systémové studie.

Závěr

Prezentované end-to-end řešení spojuje automatizovanou přípravu vzorků, robustní chromatografii, vysoce kvalitní Q-TOF detekci a pokročilou softwarovou analýzu do jediné ucelené metodiky. Workflow umožňuje rychlé a spolehlivé provedení untargeted metabolomiky i lipidomiky s vysokou důvěrou v identifikace a reprodukovatelné výsledky.

Reference

1. Huynh K.; et al. A Comprehensive, Curated, High-Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent Technologies application note, 5994-3747EN, 2021.
2. Yannell K.E.; et al. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Technologies application note, 5994-5628EN, 2023.
3. Van de Bittner G.C.; et al. Automated Fractionation of Low-Volume Plasma Samples for LC/MS Multi-Omics. Agilent technical overview, 5994-7357EN, 2024.
4. Van de Bittner G.C.; et al. Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples. Agilent technical overview, 5994-5065EN, 2022.
5. Sartain M.; et al. Illuminating the Cellular and Molecular Response to Drug Treatment by Combining Bioenergetic Measurements with LC/MS Omics. Agilent Technologies application note, 5994-7449EN, 2024.
6. Agilent Captiva EMR–Lipid Manual Fractionation of Low-Volume Plasma Samples for LC/MS Multi-Omics. Agilent method guide, 5994-7482EN, 2024.
7. Yannell K.E.; et al. Mastering HILIC-Z Separation for Polar Analytes. Agilent Technologies application note, 5994-5949EN, 2023.
8. Sartain M.; et al. An Interlaboratory Evaluation of a Targeted Lipidomics Method in Plasma. Agilent Technologies application note, 5994-6830EN, 2024.
9. Huynh K.; et al. High-Throughput Plasma Lipidomics: Detailed Mapping of the Associations with Cardiometabolic Risk Factors. Cell Chem. Biol. 2019, 26(1), 71–84.e4.
10. Duhrkop K.; et al. Searching Molecular Structure Databases with Tandem Mass Spectra Using CSI:FingerID. PNAS 2015, 112(41), 12580–12585.
11. Sartain M.; et al. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Technologies application note, 5994-2156EN, 2020.
12. Mohsin S.B.; et al. Targeted Data Mining and Annotation of Untargeted High-Resolution Lipidomics Data: A Comprehensive, High-Confidence Workflow. Agilent Technologies application note, 5994-7588EN, 2024.
13. Yannell K.E.; et al. A Comprehensive Untargeted Metabolomics LC/Q-TOF Workflow with an Unknowns Identification Strategy to Identify Plasma Metabolite Shifts in a Mouse Model. ASMS Poster, 2022.
14. Kind T.; et al. LipidBlast: in silico tandem MS library for lipid identification. Anal. Chem. 2013.
15. MassBank of North America; veřejná databáze hmotnostních spekter.
16. MassBank of Europe; veřejná databáze hmotnostních spekter.