Analysis of Oligonucleotides Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer with Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC)

Význam tématu

Rostoucí rozvoj oligonukleotidových terapeutik vyžaduje spolehlivé metody pro separaci, detekci a kvantifikaci cílových sekvencí a syntetických nečistot lišících se délkou nebo modifikacemi. Tradičně se pro separaci používá reverzně-fázová chromatografie s ion-pair reagenty, které však představují rizika kontaminace a provozní problémy. HILIC (hydrophilic interaction chromatography) nabízí separaci bez ion-pair činidel a kompatibilitu s hmotnostní spektrometrií, což je atraktivní pro rutinní LC-MS analýzu oligonukleotidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit použitelnost HILIC v kombinaci se single-quadrupole hmotnostním spektrometrem LCMS-2050 a softwarem LabSolutions Insight Biologics pro identifikaci a kvantifikaci syntetických oligonukleotidů a jejich krátkých „n-1“ a „n-3“ variant. Studie použila modelovou směs založenou na sekvenci mipomersenu (full-length produkt, FLP) a dvou chybějících nukleotidových variant.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: Nexera XS inert HPLC a LCMS-2050 (Shimadzu).
• Kolona: HILICpak VN-50 2D (Shodex).
• Mobilní fáze (primární podmínky): 100 mmol/L amonný acetát (CH3COONH4) v poměru 30:70 s vodou (A) nebo 30:70 s acetonitrilem (B); gradient: 92% B (0–1.5 min) → 72% B (do 12.5 min) → 50% B (12.51–14 min) → 92% B (14.01–17 min); průtok 0.2 mL/min; teplota kolony 60 °C; injekce 15 μL.
• Alternativně testováno: 100 mmol/L amonný hydrogenuhličitan (NH4HCO3, pH 8) v obdobném poměru (vliv pH a pufru sledován).
• Detekce UV: fotodiodeový polemný detektor 190–800 nm (záznam při 260 nm).
• MS: ESI/APCI (DUIS), negativní ionový mód; scan m/z 650–2000; suché plyny a teploty: nebulizační 3.0 L/min, drying 5.0 L/min, heating 6.0 L/min, desolvace 500 °C, DL 250 °C, rozhraní −2.0 kV.
• Software: LabSolutions Insight Biologics pro sestavení sekvencí, sloučení signálů multi-násobně nabitých iontů (multi-valent) a výpočet oblastí komponent kombinací UV a MS dat.
• Vzorky: modelová směs obsahující FLP (20 mer, MW ~7177 Da), n-1(5′) (19 mer, ~6758 Da) a n-3(5′) (17 mer, ~ ? ~6757/~? uvedené v textu) jako simulované nečistoty; koncentrace FLP 1–20 μmol/L pro linearitu, testy přídavků nečistot v rozsahu 2–50 % relativně k FLP.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separace a identifikace: HILIC v kombinaci se single-quadrupole LCMS-2050 umožnila separaci FLP a n-1/n-3 variant bez použití ion-pair činidel; jednotlivé komponenty byly úspěšně identifikovány pomocí MS a softwarem Insight Biologics.
• Vícenásobné nabití: V ESI módu byly u oligonukleotidů pozorovány multi-valent ionty (z různých stupňů nabití, např. 3+ až 9+ v závislosti na variantě); Insight Biologics agreguje signál napříč těmito nabitími pro vytvoření jednoho chromatogramu komponenty.
• Linearity a citlivost: Získaná linearita mezi koncentrací FLP a plochou vrcholu byla v intervalu 1–20 μmol/L velmi dobrá (R2 ≥ 0.999). Při testech přídavků nečistot byly varianty detekovatelné a identifikovatelné v rozmezí 2–50 % relativně k FLP (tj. 0.2–5 μmol/L při FLP 10 μmol/L). Linearity složených komponent při 2–50 % měla rovněž R2 ≥ 0.999.
• Hmotnostní přesnost: identifikační chyby hmotnosti pro FLP a varianty byly v rámci ~0.3 Da, přijatelně přesné pro single-quadrupole přístup.
• Porovnání mobilních fází: použití amonného hydrogenuhličitanu (pH 8) zvýšilo pH mobilní fáze a teoreticky podporuje deprotonaci, nicméně prakticky vedlo k poklesu MS citlivosti (asi poloviční oproti amonnému acetátu) a k postupnému zkracování retenčních časů během série analýz (vliv rozpuštěného CO2 měnícího složení pufru). Zvýšení pH na ~10 (amoniakem) citlivost nezlepšilo. Celkově byly z hlediska stability retenčních časů a citlivosti preferovány podmínky s amonným acetátem.
• Omezení: citlivost HILIC-LCMS (single quadrupole) byla nižší než u tradiční reverzně-fázové ion-pair LC-MS; autoři udávají snížení citlivosti zhruba 5–10× oproti RP-IP, což komplikuje analýzu v nízkých koncentracích.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace ion-pair činidel: HILIC umožňuje práci bez triethylaminu či dalších ion-pair reagentů, čímž se snižují bezpečnostní rizika a riziko kontaminace instrumentace.
• Univerzálnost platformy: použití standardního LC-MS systému bez dedikované konfigurace pro ion-pair analytiku zvyšuje flexibilitu laboratoře a zjednodušuje přechod mezi různými typy analýz.
• Efektivní zpracování dat: software Insight Biologics usnadňuje sestavení sekvencí, agregaci multi-nabítých iontů a kvantifikaci kombinací UV a MS signálů, čímž zrychluje interpretaci dat oligonukleotidů a jejich nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvýšení citlivosti MS: nutný další vývoj ionizačních strategií, zdokonalení zdrojů nebo použití citlivějších typů hmotnostních analyzátorů (např. Q-TOF, Orbitrap) pro analýzy v nízkých nanomolárních/plikoncentrátních úrovních.
• Optimalizace mobilních fází: vývoj stabilních nízko-CO2 pufrů nebo mobilních fází, které kombinují vysokou citlivost s dlouhodobou retencí a stabilitou gradientu.
• Rozšíření softwarových nástrojů: pokročilejší dekonvoluce multi-nabítých spekter, integrace dat z HRMS a automatizované hlášení nečistot a modifikací.
• Automatizované workflow v kontrole kvality: HILIC-LC-MS bez ion-pair činidel má potenciál stát se součástí rutinních QA/QC workflow pro syntetická oligonukleotidová léčiva, zejména tam, kde je žádoucí flexibilita instrumentace.

Závěr

Studie demonstruje, že HILIC v kombinaci se single-quadrupole LCMS-2050 a softwarem LabSolutions Insight Biologics umožňuje identifikovat a kvantifikovat syntetické oligonukleotidy a krátké nukleotidové varianty bez použití ion-pair činidel. Metoda poskytuje vynikající linearitu v testovaném rozsahu a spolehlivou identifikaci i při nízkých relativních obsahových podílech (od 2 %). Mezi hlavní limity patří nižší hmotnostní citlivost ve srovnání s RP-IP LC-MS, a rovněž stabilita retenčních časů při použití hydrogenuhličitanových pufrů. Přesto kombinace HILIC a vhodného softwaru představuje praktickou alternativu pro laboratorní pracoviště, která chtějí omezit použití ion-pair činidel a zachovat univerzálnost analytické aparatury.

Reference

1. Takamine et al., J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2023, vol.71, No.2, P51-54
2. Guimaraes et al., Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2023, 34