Analysis of Oligonucleotide Impurities Using Single Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

- Oligonukleotidové terapie představují perspektivní směr ve vývoji léků díky svému cílenému působení a rostoucímu zájmu farmaceutického průmyslu.
- Důkladná kontrola nečistot během syntézy je nezbytná pro zajištění bezpečnosti a účinnosti konečného produktu.

Cíle a přehled studie / článku

- Demonstrovat využití single kvadrupólového LC-MS (LCMS-2050) a softwaru LabSolutions Insight Biologics k analýze syntetických nečistot oligonukleotidů.
- Ukázat, že i při koeluci cílové molekuly s některými nečistotami lze díky hmotnostnímu spektru dosáhnout spolehlivé identifikace a kvantifikace.

Použitá instrumentace

• Vysokotlaký chromatograf Nexera XS inert
• Single kvadrupólový hmotnostní spektrometr LCMS-2050
• Kolona Shim-pack Scepter Claris C18-120 (100 mm × 2.1 mm, 1.9 µm)
• Detektor photodiode array (190–800 nm)
• Software LabSolutions Insight Biologics pro zpracování dat

Použitá metodika

• Reverzní fázová iontově-párová chromatografie s mobilními fázemi A (100 mmol/L HFIP, 10 mmol/L TEA ve vodě) a B (100 mmol/L HFIP, 10 mmol/L TEA v methanolu).
• Gradientní program: 15 % B (0 min) → 30 % B (6 min) → 45 % B (6,1–8 min) → 15 % B (8,1–11 min), průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 60 °C.
• ESI v negativním módu (DUIS), scan m/z 650–2000, proudy plynů: nebulizační 3 L/min, sušící 5 L/min, ohřívací 7 L/min.
• Zpracování: spojení izotopických a vícečetných iontů do jedné chromatografické stopy každé komponenty.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární odpověď signálu pro základní oligonukleotid FLP v koncentracích 1–50 µmol/L (r2 ≥ 0,999).
• Detekce a kvantifikace nečistot n-1(5′) a n-3(5′) již při přídavku 0,25 % (0,05 µmol/L) vůči FLP.
• Chromatografické oddělení n-3(5′) a koeluce n-1(5′) s FLP byly překonány použitím hmotnostní analýzy, což umožňuje přesné výpočty obsahu i při částečném překrytí peaku.
• Metoda prokázala vysokou citlivost a spolehlivost v komplexních směsích oligonukleotidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Single kvadrupólový LC-MS je cenově dostupnější a jednodušší na provoz než vysoko­rozlišovací Q-TOF přístroje.
• LabSolutions Insight Biologics automatizuje tvorbu sekvencí, zpracování izotopů a vyhodnocení množství nečistot.
• Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality a validaci výrobních procesů oligonukleotidových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření o ion mobility separaci (IMS) pro lepší rozlišení isobarických izomerů.
• Vývoj pokročilých algoritmů pro automatické návrhy modifikací a prediktivní kvantifikaci.
• Integrace online monitorování výroby a real-time QC pro vysokokapacitní syntézy.
• Aplikace na konjugované formy oligonukleotidů (např. lipid-oligonukleotidy) a biologicky zaměřené deriváty.

Závěr

- Kombinace LCMS-2050 a LabSolutions Insight Biologics poskytuje efektivní, citlivou a reprodukovatelnou platformu pro detekci, identifikaci a kvantifikaci oligonukleotidových nečistot i při nízkých koncentracích.
- Vysoce spolehlivá metoda pro kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv a podporu vývoje nových terapeutických sloučenin.

Reference

1. Ryutaro Takamine, Takao Yamaguchi, Challenges of Impurities Analysis in Manufacturing Therapeutic Oligonucleotides, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2023, vol. 71, No. 2, s. 51–54.
2. Application News No.01-00595A-EN, An Oligonucleotide Impurity Analysis Workflow Using LabSolutions Insight Biologics Software.
3. Application News No.01-00656A-EN, Simple Analysis of Impurities in Oligonucleotide Therapeutics Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer.