Sequence Confirmation of Cagrilintide Using the Agilent 1290 Infinity II Bio LC and 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF

Shrnutí: Sekvenční potvrzení cagrilintidu pomocí Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF

Význam tématu

Peptidová léčiva, zejména GLP‑1/amilinové analogy jako cagrilintide, získávají v léčbě metabolických onemocnění stále větší význam. Přesná analytická charakterizace těchto molekul — včetně intactního hmotnostního měření, určení disulfidických vazeb a lokalizace modifikací — je klíčová pro vývoj, kontrolu kvality a bezpečnost léčiv. Vysoce rozlišená LC‑MS/MS analýza umožňuje potvrzení sekvence a struktury i u složitě modifikovaných peptidů, čímž zvyšuje důvěru v identitu a integritu produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat schopnost platformy Agilent 1290 Infinity II Bio LC ve spojení s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF k komplexnímu ověření sekvence cagrilintidu. Studie zahrnovala analýzu intactní (oxidované) formy i redukované formy (po ošetření redukčním činidlem), potvrzení disulfidické vazby a lokalizaci lipofilní eikosanediové kyseliny via γ‑Glu linker pomocí vysokorozlišovacího MS/MS a fragmentačních vzorů b‑ a y‑iontů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

• Příprava: pracovní roztok 1,0 mg/mL rozpuštěný ve vodě, následné zředění na 0,2 mg/mL v mobilní fázi A (0,1 % kyselina mravenčí) před injekcí.
• Redukce: porovnání nativní (oxidované) formy a redukované formy (TCEP), aby se ověřila přítomnost a pozice disulfidické vazby; očekávaný posun hmotnosti ~+2 Da při redukci.
• LC separace: kolona Agilent Altura Peptide Plus 2.1 × 150 mm, 2.7 µm; gradient 30 min, teplota kolony 40 °C, průtok 0.4 mL/min, injekční objem 1 µL. Klíčové body gradientu: počátečně 20 % B, nárůst do 60 % B kolem 20 min, návrat do výchozího stavu do 30 min.
• MS/MS: získávání spekter v pozitivním ionizačním módu s duálním AJS ESI; rozsah MS 300–3 200 m/z, MS/MS 50–3 200 m/z; izolace s úzkým oknem (~1.3 m/z); řízení kolizní energie automaticky, cílení až 3 prekurzorů/cyklus, aktivní vyloučení po 2 spektrách s uvolněním po 0.2 min.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC systém (moduly: G7120A pumpa, G7137A multisampler, G7116B multicolumn thermostat)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF (G6549AA) s duálním AJS ESI
• Kolona: Agilent Altura Peptide Plus, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm (part no. 227215‑903)
• Softwarové nástroje: Agilent MassHunter Data Acquisition v11.0, MassHunter BioConfirm v12.1, MassHunter Qualitative Analysis v12.0

Klíčové parametry LC a MS (shrnutí tabulek)

LC parametry zahrnovaly 30minutový gradient s počátečním vysokým podílem vodné fáze (0.1 % FA) a teplotu columny 40 °C; průtok 0.4 mL/min. MS parametry kladly důraz na vysokou citlivost a přesnost: ESI v pozitivním módu, drying gas 270 °C/11 L/min, sheath gas 375 °C/11 L/min, capillary 3 500 V, nozzle 500 V, fragmentor 175 V, úzké izolační okno pro selektivní MS/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intact mass analýza: Pro obě formy (nativní i redukovaná) byl v TIC pozorován jediný chromatografický vrchol, což svědčí o čistotě vzorku a konzistentní separaci. Spektrální data prokázala více nábojových stavů ((M+3H)3+, (M+4H)4+, (M+5H)5+), umožňující spolehlivou dekonvoluci do intactní hmotnosti. Redukcí disulfidické vazby byl zaznamenán očekávaný nárůst hmotnosti ~2 Da.
• Fragmentační data (MS/MS): Vysoce rozlišená MS/MS spektra pro obě stavy ukázala rozsáhlé série b‑ a y‑iontů pokrývající páteř peptidu, což umožnilo jednoznačné přiřazení aminokyslové sekvence. Fragmentační „žebříčky“ poskytly systematické pokrytí a vysokou kvalitu signálu pro většinu pozic.
• Diagnostické ionty pro disulfidické vazby: Cílená analýza klíčových fragmentů (b7 a y36) ukázala konzistentní posun +2 Da mezi nativní a redukovanou formou, potvrzující redukci disulfidu. Fragmentační vzory zůstaly zachovány, což potvrzuje, že změna byla lokalizovaná na disulfidickou vazbu, nikoli na rozbití páteře peptidu.
• Kvalita dat: Deconvoluovaná spektra vykazovala dobře rozlišené izotopické rozložení a vysokou přesnost hmotnosti, což indikuje stabilní výkon Q‑TOF instrumentu a vhodnost pro rutinní charakterizaci peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Ověření identity a integrity peptidu: Kombinace intact mass a MS/MS poskytuje robustní důkaz identity a úplnosti syntézy komplexních peptide therapeutics.
• Lokalizace post‑syntetických modifikací: Metoda umožňuje potvrdit přítomnost a pozici lipofilních konjugátů (eikosanediová kyselina‑γ‑Glu) a ověřit disulfidická propojení.
• Kontrola kvality a vývoj procesů: Workflow je vhodný pro QC laboratorní rutinu i pro fáze vývoje léčiva, kde je potřeba rychle potvrdit strukturální integritu šarží.
• Vysoká citlivost a spolehlivost: Duální AJS ESI a optimalizované LC podmínky poskytují dobrý signál i pro větší peptidy s různými nábojovými stavy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace iontové mobility: přidání separace podle konformace (ion mobility) by mohlo zlepšit rozlišení izomerů a konformačních stádií peptidů.
• Top‑down a middle‑down přístupy: rozšíření na analyzy větších fragmentů či intactních proteinů pro ještě detailnější mapování PTM a variant.
• Automatizace a AI‑pomocná interpretace: pokročilé algoritmy pro automatické přiřazení fragmentů a hodnocení kvality dat urychlí rutinní interpretaci a sníží lidské chyby.
• Native MS a studium komplexů: u peptidových léčiv s vázanými excipienty nebo nosiči bude přínosné rozšíření metodiky o ne-denaturující podmínky.

Závěr

Studie ukázala, že kombinace Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF umožňuje přesnou, reprodukovatelnou a detailní charakterizaci cagrilintidu. Intact mass analýza spolu s vysokorozlišovací MS/MS poskytla jednoznačné potvrzení sekvence, ověření disulfidické vazby a identifikaci modifikací. Tento workflow je vhodný pro analytickou podporu vývoje i kontrolu kvality peptidových terapeutik.

Reference

1. Lau, D. C. W.; Erichsen, L.; Francisco, A. M.; et al. A Randomized, Controlled Trial of Cagrilintide for Weight Management. New England Journal of Medicine 2021, 385, 228–239.
2. Lau, J.; Bloch, P.; Schaffer, L.; et al. Discovery of the Once‑Weekly Glucagon‑Like Peptide‑1 (GLP‑1) Analogue Semaglutide and Related Amylin Analogues. Journal of Medicinal Chemistry 2015, 58, 7370–7380.
3. Agilent Technologies. Workflow Solutions for Peptide Therapeutics. Application compendium, publication number 5994‑8771EN, 2025.