Peptide Mapping of Trastuzumab Tryptic Digests on an Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčovou technikou v biofarmaceutickém průmyslu pro potvrzení primární struktury, lokalizaci posttranslačních modifikací a kontrolu glykozylace. Vysoce citlivé a přesné LC-MS/MS metody umožňují validovat konzistenci terapeutických proteinů, což je zásadní pro zajištění jejich účinnosti a bezpečnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout a ověřit robustní workflow pro peptidové mapování trastuzumabu pomocí Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Studie popisuje optimalizaci přípravy vzorku, chromatografické a hmotnostně-spectrometrické parametry a zpracování dat v softwaru MassHunter BioConfirm pro dosažení vysokého pokrytí sekvence a spolehlivé identifikace modifikací.

Použitá metodika

• Redukce a alkylace: Trastuzumab (22 mg/mL) denaturován guanidinem (6,4 M) a redukován DTT (0,2 M) při 37 °C, následně alkylován iodoacetamidem (0,4 M).
• Digestion: Směs Trypsin/LysC (poměr 25:1) inkubována přes noc při 37 °C, reakce zastavena 10 % TFA.
• Ředění: Po digestion přidán Tris-HCl pro snížení koncentrace guanidinu na 1 M.
• Zpracování dat: Hledání peptidů v BioConfirm s tolerancemi ±5 ppm (MS1) a ±20 ppm (MS2), BioScore ≥ 5, filtrace nízkokvalitních spekter.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: Agilent 1290 Infinity II Bio LC, kolona AdvanceBio Peptide Mapping 2,1 × 150 mm, 2,7 µm, gradient 2–40 % ACN ve 70 min při 0,4 mL/min, teplota 50 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI, fragmentor 95 V, rozlišení MS1 3 spektra/s (m/z 200–3000), MS/MS top 5 precusorů, rychlost 3 spektra/s.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dosaženo průměrného pokrytí sekvence 98–99,7 % pro lichté řetězce trastuzumabu (s výjimkou glykanového místa N300).
• Detekce autolytických peptidů trypsinu s 54 % pokrytím, žádné peptidy z LysC.
• Nastavení fragmentoru na 95 V minimalizovalo zdrojovou fragmentaci a zachovalo vysoký signál.
• MS/MS spektra pro nízkomnožné peptidy (MS1 ~1 × 10^4) ukazují téměř úplné b- a y-laddery.
• Určení deamidace peptidu FTISADTSKNTAYLQMNSLR na pozici 17 díky charakteristickému posunu fragmentních iontů.
• Identifikace různých glykoform na peptidu TKPREEQYNSTYR včetně G0F, G1F, G2F s MS1 signály v řádu 10^5 a potvrzení struktury pomocí MS/MS i pro velké glykopeptidy (4+).

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysokému pokrytí sekvence a spolehlivé detekci PTM lze metodu využít pro rutinní kontrolu kvality bioterapeutik, expedici stability protokolů a podporu regulativních požadavků. Workflow je přenositelné i na jiné monoklonální protilátky a náročné modifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků pro vyšší reprodukovatelnost a throughput.
• Rozšíření modifikací o nové PTM (fosforylace, sulfatace) a nestandardní glykany.
• Integrace umělé inteligence pro pokročilé zpracování spekter a predikci glykoform.
• Využití vysokorozlišovacch Q-TOF instrumentů pro komplexní analýzu vzorků s nízkou koncentrací.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF dosahuje vynikajícího pokrytí sekvence trastuzumabu a citlivé detekce nízkomnožných peptidů i komplexních glykopeptidů. Optimalizace instrumentálních parametrů a robustní zpracování dat zaručují spolehlivou identifikaci PTM a podporují kvalitu bioterapeutik.

Reference

1. Zheng K.; Bantog C.; Bayer R. The Impact of Glycosylation on Monoclonal Antibody Conformation and Stability. MAbs 2011, 3(6), 568–576.
2. Mouchahoir T.; Schiel J. E. Development of an LC-MS/MS Peptide Mapping Protocol for the NISTmAb. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(8), 2111–2126.
3. Kim S.; Gupta N.; Pevzner P. A. Spectral Probabilities and Generating Functions of Tandem Mass Spectra: A Strike Against Decoy Databases. J. Proteome Res. 2008, 7(8), 3354–3363.