An Integrated Workflow for Peptide Mapping of Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek (mAb) je klíčovou metodou pro potvrzení primární struktury a identifikaci post-translačních modifikací (PTM) jako je oxidace methioninu nebo deamidace asparaginu. Přesné a reprodukovatelné stanovení sekvence a kvantifikace PTM je nezbytné pro vývoj, kontrolu kvality a registraci bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie představuje integrovaný a vysoce propustný pracovní postup pro peptidové mapování mAb, který kombinuje automatizované zpracování vzorků, LC/MS/MS analýzu a softwarovou automatizaci datové analýzy. Cílem je zvýšit reprodukovatelnost, škálovatelnost a detailní charakterizaci sekvence a PTM.

Použitá metodika a instrumentace

Postup je založen na následujících krocích a zařízeních:

• Vzorek: standardní NIST mAb RM 8671 ve formě 0,5–100 µg na vzorek.
• Automatizace vzorků: Agilent AssayMAP Bravo pro denaturaci, redukci, alkylaci, štěpení enzymatickou směsí Trypsin/Lys-C a čistění na C18 kazetách.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC systém s kolonou AdvanceBio Peptide Mapping (2,1×150 mm, 2,7 µm), gradient 5–90 % ACN/0,1 % FA za 20 minut, průtok 0,4 mL/min, teplota kolonky 60 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS/MS s Dual JetStream ESI, režim Extended Dynamic Range, top-10 MS/MS, rozsah m/z 100–1700.
• Softwarová analýza: Agilent MassHunter BioConfirm B.08 pro extrakci molekulárních signálů, porovnání se známou sekvencí, identifikaci PTM a mapování pokrytí sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

• Průměrné pokrytí sekvence >95 % pro všechna množství štěpeného mAb (0,5–100 µg) při osmi replikátech.
• Významné PTM: oxidace Met 4 (0,43 %) a deamidace Asn 136 (1,21 %), Asn 137 (0,25 %) a Asp 136 (1,38 %) ve svazku peptidu, potvrzené site-specific MS/MS fragmenty a kvantifikované z ECC.
• Reprodukovatelnost: CV pro opakované injekce LC/MS ~1,4 %; pro kompletní přípravu vzorků 3,5–6,3 %; u 17 peptidů CV <10 %, u 7 mezi 10–20 %, u 4 >20 %.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný pracovní postup výrazně snižuje variabilitu mezi operátory a šaržemi, zkracuje dobu přípravy vzorků a umožňuje vysokou propustnost analýz. Poskytuje detailní data o primární sekvenci a místně specifických PTM, což je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality bioléků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozšíření zahrnují integraci afinitní purifikace (protein A/G, streptavidin) pro složité matrice (buněčné kultury, plazma) a kombinaci s dalšími proteomickými technologiemi. Další vývoj softwaru může přinést komplexnější analýzy glykování a dalších vzácných modifikací.

Závěr

Popsaný integrovaný workflow spojuje robotickou automatizaci, výkonnou chromatografii, přesný Q-TOF MS a sofistikovanou datovou analýzu v jediném postupu, který nabízí vysokou reprodukovatelnost, škálovatelnost a detailní charakterizaci mAb.

Reference

1. Greer FM. MS Analysis of BioPharmaceutical Products. Innovation in Pharmaceutical Technology. 2001;83–90.
2. High Resolution and Rapid Peptide Mapping of Monoclonal Antibody Using an Agilent 1290 Infinity UHPLC and an Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS System. Agilent Technologies, 2017.
3. Robinson NE, Robinson AB. Protein Deamidation. PNAS. 2002;99(8):5283–5288.
4. Automation for LC/MS Sample Preparation: High Throughput In-Solution Digestion and Peptide Cleanup Enabled by the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Agilent Technologies, 2016.