Sensitive Quantitation of Cereulide in Infant Formula Following ISO 18465:2017

Význam tématu

Cereulid je lipofilní, tepelně stabilní emetický toxin produkovaný některými kmeny Bacillus cereus. Vzhledem k tomu, že je bez zápachu a chuti, představuje skryté riziko kontaminace potravin; zvláště zranitelnou skupinou jsou kojenci konzumující infantní mléčné formule. Nedávné stažení šarží kojeneckých přípravků zdůraznilo potřebu citlivých a validovaných analytických postupů pro včasné zachycení nízkých hladin tohoto toxinu a pro snížení rizika zdravotních dopadů a ekonomických škod spojených s odvoláním produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a validovat kvantitativní analytický workflow pro stanovení cereulidu v infantní formuli v souladu s normou ISO 18465:2017. Požadavkem bylo dosáhnout analytické citlivosti pod hranicemi uváděnými EFSA a příslušnými předpisy EU, při zachování jednoduché, robustní a vysokoprůchodové přípravy vzorku vhodné pro rutinní kontrolní laboratoře.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika: extrakce vzorku probíhá jednoduchým extraktem acetonitrilem: 2,5 g vzorku se přidá acetonitril, třese se 60 minut, odstředí se 10 minut při nízké teplotě, následně se supernatant filtruje PTFE 0,22 µm a injektuje do LC/MS (5 µL). Kalibrace byla provedena matricově adaptovanými standardy v rozmezí 0,0021–0,84 µg/L (7 bodů). Hodnocení recovery bylo prováděno před a po extrakci (pre/post spike) na nízké, střední a vysoké úrovni; matrix effect byl posouzen porovnáním post‑extract spike vs. neat roztok.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity III UHPLC (pumpa G7120A, autosampler G7167B, termostat G7116B)
• Analytický sloupec: Agilent Altura ZORBAX Eclipse Plus C18, 2.1 × 50 mm, 1.8 µm; strážný sloupec ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 × 5 mm, 1.8 µm
• Mobilní fáze: A = 10 mM ammonium formát + 0,1 % kyselina formiová, B = 0,1 % kyselina formiová v acetonitrilu; průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 40 °C
• Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS s ionizačním zdrojem Agilent Jet Stream (AJS) v režimu MRM
• Optimální MRM přechody pro cereulid: prekurzor [M+NH4]+ m/z 1170.7; produktové ionty m/z 172.1 (kvantifikátor), 314.2, 1125.7
• Parametry MS: drying gas 11 L/min při 290 °C, sheath gas 11 L/min při 400 °C, nebulizér 35 psi, kapilární napětí 5000 V
• Software: Agilent MassHunter (acquisition 12.2, Quant 12.1) s automatizovaným Agilent MRM Optimizer

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LOQ 0,0021 µg/L (ekvivalent 0,025 µg/kg vzorku) při S/N > 12.9, což výrazně překračuje požadavky EFSA/EU (např. EFSA 0,054 µg/L pro kapalné formule). Kalibrace byla linearizovaná v rozsahu 0,0021–0,84 µg/L s R2 > 0,9995. Extrakční výtěžnost překračovala 80 % napříč všemi úrovněmi (82,3–82,9 %) s nízkou variabilitou (%RSD ≤ 2,21 %). Repeatabilita na úrovni LOQ vykázala %RSD 3,06 % (n = 6), což potvrzuje vysokou přesnost na stopových hladinách. Matrix effect byl minimální (108 %), čímž bylo potvrzeno, že jednoduché acetonitrilové čištění + filtrace a diverter program účinně snižují potlačení/zesílení ionizace. Aplikace na reálný kontaminovaný vzorek vedla ke kvantifikaci cereulidu 0,0036 µg/L (0,043 µg/kg), což potvrzuje použitelnost metody v autentických matricích.

Metoda tak kombinuje vysokou citlivost, dobrou přesnost a jednoduchost přípravy, přičemž krátký celkový běh (cca 11,5 min) podporuje vysokou průchodnost laboratoře. Použití více MRM přechodů zvyšuje specifičnost a snižuje riziko falešně pozitivních výsledků způsobených izobarickými interferencemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost rutinního screeningu a kvantitativního monitoringu cereulidu v infantních formulích na hladinách pod regulačními limity.
• Jednoduchá a nákladově efektivní příprava vzorku vhodná pro vysoký počet vzorků v krátkém čase.
• Robustní validace v souladu s ISO 18465:2017 – vhodné pro laboratoře provádějící oficiální kontroly, QA/QC a vyšetřování epidemiologických událostí.
• Minimalizace zásahů do instrumentace díky diverter programu, který chrání MS před matricí, a tím snižuje potřebu častých údržbových zásahů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Začlenění izotopově značeného interního standardu by dále zlepšilo kvantifikaci a kompenzaci zbytkových matrixových efektů.
• Automatizace přípravy a robotizované extrakce pro zvýšení throughput a snížení variability mezi operátory.
• Rozšíření validace na další potravinové matice (vařená rýže, těstoviny, hotová jídla) a zajištění srovnatelné citlivosti v různorodých matricích.
• Integrace s rychlou screeningovou technikou (např. vysokopropustná LC‑MS/MS nebo cílené HRMS workflow) pro škálovatelnou odezvu při výskytech rozsáhlejších kontaminací.
• Vývoj domácích nebo polopřenosných řešení pro rychlé záchyty na místě výroby zatím vyžaduje pokrok v mobilní MS technologii a jednoduchých přípravných modulech.

Závěr

Popsaný postup podle ISO 18465:2017 nabízí citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení cereulidu v infantní formuli s LOQ 0,0021 µg/L (0,025 µg/kg), vynikající liniaritou, stabilními výtěžnostmi a nízkým matrixovým vlivem. Metoda je prakticky použitelná pro rutinní monitoring a vyšetřování reálných případů kontaminace a přispívá k lepší ochraně zdraví kojenců a ke snížení rizika nákladných stažení produktů.

Reference

• European Food Safety Authority (EFSA). EFSA Provides Rapid Risk Assessment on Cereulide in Infant Formula; EFSA: Parma, Italy, February 2, 2026.
• European Commission, Directorate‑General for Health and Food Safety. Result of the EFSA Rapid Risk Assessment (RRA) on Acute Reference Dose (ARfD) of Cereulide in Infants and Information on Acute Consumption of Infant Formulae; European Commission: Brussels, Belgium, 2026.
• European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2026/459 of 24 February 2026 Amending Implementing Regulation (EU) 2019/1793; Official Journal of the European Union, 2026.