Analysis of Cereulide in Reconstituted Infant Formula Using Triple Quadrupole LC-MS/MS

Význam tématu

Monitoring cereulidu — tepelně stabilního emetického toxinu produkovaného Bacillus cereus — je klíčový zejména u kojeneckých výživ, kde i velmi nízké koncentrace mohou vyvolat zdravotní potíže. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) stanovil pro kojence akutní referenční dávku (ARfD) 0,014 µg/kg tělesné hmotnosti a rizikový mezní bod v rekonstituovaném mléku cca 0,054 µg/L. Kvůli složité matrici kojeneckých mlék (vysoký obsah tuků a bílkovin) je nezbytné validované, citlivé a reprodukovatelné analytické řešení pro nízké koncentrace cereulidu.

Cíle a přehled studie

Autoři porovnali dvě přístupné a prakticky využitelné předúpravy vzorku — postup založený na ISO 18465 a extrakci typu QuEChERS — pro kvantifikaci cereulidu v komerčně dostupném rekonstituovaném kojeneckém mléce pomocí triple kvadrupólového LC‑MS/MS. Hodnocení zahrnovalo spike‑and‑recovery testy při hodnotě 0,054 µg/L (hranice relevantní vzhledem k EFSA), posouzení kalibrační křivky a vyhodnocení matričního efektu.

Použitá metodika

ISO 18465 založený postup:

• 2,5 mL rekonstituovaného vzorku + 30 mL acetonitrilu.
• míchání 1 h na shakeru, následné centrifugování 3 000 rpm, 5 min.
• filtrace supernatantu přes hydrophilic PTFE 0,45 µm (TORAST Disc) před LC‑MS/MS.

QuEChERS postup:

• 2 mL vzorku + 8 mL vody + 150 µL kyseliny mravenčí + 10 mL acetonitrilu; krátké promíchání.
• přidání extrakčního balíčku (Supel QuE), prudké protřepání, 5 min na shakeru, centrifugace 3 000 rpm, 5 min.
• supernatant použit přímo pro analýzu.

Obě metody byly testovány v trojím opakování (n = 3) a v rámci měření byly provedeny i post‑spike pokusy pro posouzení matričního efektu.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Nexera X3 (Shimadzu).
• Kolona: Shim-pack Scepter C18-120 (50 × 2.1 mm, 1.9 µm).
• MS: LCMS‑8060RX (triple kvadrupól), ionizace ESI v pozitivním módu, režim MRM.
• HPLC parametry: průtok 0,4 mL/min, gradient acetonitril/10 mM amonná sůl + 0,1 % kyselina mravenčí (metoda 13 min včetně promývání), injekční objem 5 µL, teplota kolony 40 °C.
• MRM tranzice používané pro kvantifikaci: např. m/z 1170.70 → 172.05 (kvantifikátor) a doplňující kvalifikátory 314.15, 357.30, 499.10.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace a citlivost:

• Kalibrační křivka externí standardní metody byla lineární v rozsahu 0,002–0,1 µg/L s koeficientem determ. R² ≈ 0,9997 a přesností jednotlivých bodů 98,1–105,1 %.

Přínos předúprav:

• Finalní koncentrace ve vstřikovacích lahvičkách po přípravě: 0,0045 µg/L (ISO) a 0,0108 µg/L (QuEChERS).
• Spike‑and‑recovery (pre‑spiked při 0,054 µg/L): průměrné recoveries 90,6 % pro postup podle ISO 18465 a 100,1 % pro QuEChERS.
• Reprodukovatelnost (%RSD): 9,7 % (ISO) vs. 2,3 % (QuEChERS), což indikuje lepší preciznost QuEChERS pro tento typ matrice.
• Post‑spiked (hodnocení matričního efektu): recoveries ~108,7–109,3 % pro obě metody, což naznačuje mírné zvýšení signálu při ionizaci způsobené matricí (matriční efekt vykazující ionizační enhancement).

Důsledky:

• Obě metody umožňují spolehlivou kvantifikaci cereulidu při úrovních relevantních vzhledem k doporučení EFSA (0,054 µg/L).
• QuEChERS vykázal lepší celkové zotavení a vyšší reprodukovatelnost v porovnávaném vzorku rekonstituovaného kojeneckého mléka.

Přínosy a praktické využití metody

• Metody poskytují robustní a dostatečně citlivé řešení pro rutinní kontrolu cereulidu v kojeneckých výživách, podporující shodu s bezpečnostními limity a rychlé rozhodování v bezpečnostních incidentech.
• QuEChERS přináší výhodu rychlé předúpravy s vyšší reprodukovatelností, což je výhodné pro vysokopropustné laboratorní provozy.
• Externí kalibrace bez použití interního standardu byla v tomto srovnání dostatečně přesná; pro další zvýšení spolehlivosti při různých matricích však může být vhodné uvažovat stabilně označené interní standardy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření validace na širší spektrum komerčních formulí (různé obsahy tuku, proteinu) a na sušené směsi před rekonstitucí.
• Implementace izotopových interních standardů pro korekci matričních efektů a zvýšení robustnosti kvantifikace mezi laboratořemi.
• Využití vysokého rozlišení (HRMS) pro potvrzení strukturálních izomerů a případné screeningové aplikace pro širší spektrum toxických peptidů produkovaných B. cereus.
• Automatizace předúpravy vzorků (robotizované QuEChERS) pro zvýšení throughputu a snížení variability operátora.
• Standardizace metod napříč regulačními orgány a akreditace postupů pro oficiální kontrolu potravin.

Závěr

Studie demonstruje, že jak postup založený na ISO 18465, tak QuEChERS v kombinaci s triple kvadrupólovým LC‑MS/MS poskytují citlivou a spolehlivou kvantifikaci cereulidu v rekonstituovaném kojeneckém mléce při úrovních relevantních pro EFSA. QuEChERS v testovaném případě nabídla vyšší recovery a lepší reprodukovatelnost, zatímco obě metody vykázaly matriční enhancement, který je třeba zvážit při kvantifikaci. Pro rutinní screening a potvrzovací analýzy je navrhované řešení vhodné, přičemž další úpravy (např. interní standardy, rozšířená validace) mohou zvýšit mezinárodní porovnatelnost a robustnost výsledků.

Reference

1. European Food Safety Authority (EFSA), Eskes C, et al. Rapid risk assessment on acute reference dose (ARfD) of cereulide in infants and information on acute consumption of infant formulae. EFSA Journal, 2026.
2. ISO 18465. Microbiology of the food chain - Quantitative determination of emetic toxin (cereulide) using LC‑MS/MS. 2017.