Untargeted metabolomics of murine wound samples

Význam tématu

Porozumění metabolomu v ranách je klíčové pro odhalení molekulárních mechanismů hojení, vlivu mikrobiomu a rozdílů vyplývajících ze zdravotního stavu hostitele (např. obezity). Identifikace metabolitů asociovaných s ránou může odhalit biochemické dráhy ovlivňující zánět, angiogenezi a regeneraci tkáně a zároveň nabídnout potenciální biomarkery či cíle pro terapii.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat neřízený (untargeted) metabolomický profil kožních ran u zdravých a dietou indukovaných obézních myší a zjistit, zda existují signifikantní rozdíly, které by byly spojeny s přítomností mikrobiomu. Analyzováno bylo celkem 22 vzorků rány (14 zdravých, 8 obézních), včetně germ-free a krátkodobě kolonizovaných zvířat. Studie sledovala také možnost, že některé nalezené signály mohou pocházet z exogenních zdrojů (laboratorní plasty, pipetovací špičky).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Postup přípravy a zpracování vzorků podle workflow Olivera Fiehna pro savčí tkáně (extrakce, kvalita, data processing).
• Odběr a zpracování: z každé rány ~10 mg tkáně, homogenizace nerezovými kuličkami a extrakce chladným směsným rozpouštědlem acetonitril/isopropanol/voda (3:3:2, v/v/v).
• Po odstředění a vakuovém vysušení proběhla dvou-kroková derivatizace: methoxymethyloximace (MeOx) v pyridinu a následně s použitím směsi FAMEs/MSTFA.
• Data zpracována standardními softwarovými nástroji: MSDIAL pro EI-data, MetaboAnalyst pro statistiku EI, MetaboScape (Bruker) pro CI-data a doplňující anotace.

Instrumentace:

• ecTOF GC/MS platforma (Bruker Daltonics) umožňující simultánní získání elektronové ionizace (EI, 70 eV) a chemické ionizace (CI, jako reaktivní plyn použit amoniak) v jednom analytickém běhu.
• Chromatografie s časovým rozlišením trajektorie 25 minut.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové výsledky:

• CI-data (vyhodnoceno v MetaboScape) ukázala pět signifikantně diferencovaných rysů (log2FC > 1, pravděpodobnostní p < 0,05) při porovnání ran zdravých vs. obézních myší s mikrobiomem — čtyři rysy byly zvýšené ve zdravých vzorcích a jeden byl zvýšený v obézních.
• EI-analýza (MSDIAL + MetaboAnalyst) rovněž identifikovala pět signifikantních rysů, všechny s vyšší abundancí ve zdravých ranách.
• Putativní anotace významných rysů zahrnovala: kyselinu mléčnou, 13-docosenamid (Z)-, glycerol, 9-hexadecenoickou kyselinu (Z)- a ethyl oleát.
• 13-Docosenamid (Z)- byl zajímavý tím, že byl nalezen jako signifikantní v obou analytických tocích (EI i CI). Tento lipidový amid je v literatuře popisován jako potenciální modulator angiogeneze.

Diskuse a omezení:

• Nalezené rozdíly nebyly přítomny u germ-free zvířat, což naznačuje možnou asociaci s mikrobiomem.
• Všechny anotace jsou putativní a založené na databázových shodách; chybí potvrzení pomocí analytických standardů a kvantitativní validace.
• 13-Docosenamid může být také exogenní kontaminant (přísada do polymerů nebo migrace z pipetovacích špiček); nebyl však detekován v derivačních a metodologických blank vzorcích studie. Přesné odlišení biologického původu vyžaduje další kontroly.
• Malý počet vzorků (n=22) omezuje statistickou sílu a obecnost závěrů; výsledky je třeba interpretovat opatrně.

Přínosy a praktické využití metody

Metodický přínos:

• Integrace EI a CI v jednom běhu (ecTOF) zvyšuje jistotu anotací díky komplementární informační hodnotě obou ionizačních režimů.
• Workflow založený na osvědčených postupech (Fiehn) je vhodný pro neřízené profilování malých molekul v tkáňových vzorcích.

Praktické využití:

• Identifikované metabolity — zejména pokud budou následně potvrzeny — mohou sloužit jako kandidátní biomarkery hojení rány závislého na mikrobiomu nebo stavu hostitele (obezita).
• Metodika je přenositelná do laboratorních studií zaměřených na farmaceutický vývoj, QA/QC v biomedicínském výzkumu a preklinické modely hojení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření počtu vzorků a zahrnutí více časových bodů hojení pro lepší statistickou validitu a dynamiku metabolomických změn.
• Systematické ověřování putativních anotací pomocí analytických standardů a případně izotopově značených interních standardů pro potvrzení původu a kvantifikaci.
• Metodologické kroky pro minimalizaci kontaminací (testy plastových spotřebičů, validované blanky) a použití alternativních materiálů, pokud je podezření na exogenní zdroje signálů.
• Propojení metabolomických dat s metagenomikou/metatranskriptomikou za účelem přímého spojení metabolitů s mikrobiálními taxa a funkcemi.
• Aplikace orthogonálních analytických technik (LC-MS, NMR) pro zvýšení pokrytí metabolomu a potvrzení struktur.

Závěr

Studie demonstruje, že untargeted GC-MS workflow s kombinovanou EI/CI analýzou pomocí ecTOF platformy dokáže odhalit rozdíly v metabolomickém profilu kožních ran mezi zdravými a dietou indukovanými obézními myšmi, přičemž některé signifikantní rysy se jeví jako asociované s přítomností mikrobiomu. Mezi putativní kandidáty patří kyselina mléčná a 13-docosenamid (Z)-, přičemž právě 13-docosenamid vykazuje konzistenci mezi analýzami, ale jeho biologická relevance může být zpochybněna možnou exogenní kontaminací. Další validace a rozšířená experimentální sada jsou nutné pro potvrzení těchto výsledků a jejich biologické interpretace.

Reference

1. Fiehn O. Metabolomics by Gas Chromatography-Mass Spectrometry: Combined Targeted and Untargeted Profiling. Current Protocols in Molecular Biology. 2016;114:30.4.1–30.4.32.
2. Scalise MC, Simon M, Bernhardt J, et al. Defined Microbiota Modulates Host Metabolome and Skeletal Adaptation to Diet-Induced Obesity. The FASEB Journal. 2026;40:e71831.
3. Brezeanu D, Brezeanu A-M, Chirila S, Tica V. The Role of Lactic Acid in Episiotomy Wound Healing: A Systematic Review. Healthcare. 2025;13:956.
4. Hamberger A, Stenhagen G. Erucamide as a Modulator of Water Balance: New Function of a Fatty Acid Amide. Neurochemical Research. 2003;28:177–185.
5. Molnar NM. Erucamide. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 1974;51:84–87.
6. Watson J, Greenough EB, Leet JE, et al. Extraction, Identification, and Functional Characterization of a Bioactive Substance from Automated Compound-Handling Plastic Tips. Journal of Biomolecular Screening. 2009;14:566–572.