Novel data processing workflow including in-silico derivatization for integrated CI & EI MS data acquired with the GC-ecTOFinstrument

Význam tématu

Komplexní analýza těkavých a polosumyslných organických sloučenin pomocí GC-MS je klíčová v environmentálním monitoringu, potravinářství, aroma průmyslu i metabolomice. Kombinace dvou komplementárních ionizačních režimů — měkké chemické ionizace (CI) a tvrdé elektronové ionizace (EI) — na jednom přístroji (GC-ecTOF) výrazně zvyšuje jistotu identifikace neznámých komponent a současně podporuje kvantitativní workflowy. Nové softwarové postupy pro zpracování dat, včetně in-silico derivatizace a in-silico fragmentace, překonávají omezení tradičních nominálních EI knihoven a umožňují efektivní přechod od neřízeného profilování k rutinnímu cílenému screeningu.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo vyvinout a demonstrovat novou datovou workflow pro integrované zpracování CI a EI dat získaných na GC-ecTOF. Hlavní body studie zahrnují: detekci a sledování neřízených (untargeted) signálů v proudu CI, rekonstrukci souvisejících EI fragmentačních spekter, automatickou in-silico derivatizaci cílových sloučenin pro lepší shodu s experimentálními daty a bezproblémový přenos anotací do softwaru pro cílené screenování a kvantifikaci (TASQ). Aplikace je demonstrována na dvou sadách derivatizovaných biologických vzorků (myší rány a fekálie).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: dva derivační protokoly — dvoustupňová MeOX/MSTFA derivatizace pro vzorky rán a MTBSTFA derivatizace pro fekálie.
• Akvizice: GC-ecTOF (Bruker) současně sbírá CI a EI signály z chromatografického rozdělení.
• Zpracování dat: konverze do TSF formátu, následné zpracování v prototypech MetaboScape a TASQ.
• Detekce: untargeted feature finding probíhá v CI proudu s de-isotopingem a kombinací typických CI aduktů a fragmentů (např. [M-CH3]+, [M]+, [M+H]+, [M+NH4]+ atd.).
• Retenční čas a m/z: napříč vzorky se provádí registrace feature a následné zarovnání retenčních časů; pro anotaci se využívají přesná monoisotopická m/z a izotopový vzor.
• Rekonstrukce EI: MetaboScape vytváří vážené průměrné EI fragmentační spektrum pro každou CI feature na základě EI spekter koelutujících se signálů, referencovaných k monoisotopickému EIC CI signálu.
• In-silico postupy: cílový seznam (jméno, neutrální vzorec, InChI/SMILES) je dynamicky rozšiřován o možné deriváty; následně se provádí in-silico fragmentace pro porovnání s rekonstruovanými EI spektry.

Instrumentace:

• GC-ecTOF (Bruker Daltonics): kombinovaná chemická ionizace (CI) a elektronová ionizace (EI) s vysokou hmotnostní přesností.
• Software: MetaboScape (pro feature finding, in-silico derivatizaci a rekonstrukci EI spekter) a TASQ (pro automatizovaný cílený screening a kvantifikaci).
• Datový formát: TSF pro výměnu dat mezi akvizicí a zpracováním.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní výstupy workflowu jsou následující:

• Efektivní untargeted detekce v CI: CI poskytuje přesné monoisotopické m/z a izotopové rozložení, které slouží jako silný vstup pro registraci feature a vyhledávání v databázích.
• Rekonstrukce a přiřazení EI spekter: vážené průměrné EI spektrum vztahované k CI EIC umožňuje využít fragmentační informace i tam, kde chybí referenční EI záznam v knihovnách.
• In-silico derivatizace zvyšuje šanci na správnou anotaci zejména u derivatizovaných analytů (MTBSTFA, MSTFA); automatické generování derivátů z InChI/SMILES rozšiřuje cílový seznam bez potřeby fyzicky dostupných standardů.
• Vícenásobná kritéria pro hodnocení: kombinace přesné hmotnosti CI, izotopového vzoru a charakteristických EI fragmentů zvyšuje jistotu anotací a snižuje počet falešně pozitivních identifikací.
• Přenos do rutinního režimu: MetaboScape umí automaticky vytvořit TASQ metodu (název, vzorec, struktura, retenční čas, přesné m/z CI a specifické EI ionty), což umožňuje rychlý přechod od profilování k targetovanému screeningu a kvantifikaci.

Diskuse také upozorňuje na parametry anotace: použité prahové hodnoty přesnosti masek byly nastaveny na úzké/široké hodnoty 2.0/5.0 mDa a limity mSigma 20/100, což umožňuje flexibilní balanc mezi citlivostí a specifitou anotace.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody řešení:

• Zvýšená identifikační jistota díky ortogonálním datům (CI přesné m/z a EI fragmenty).
• Možnost anotovat sloučeniny bez dostupných standardů díky in-silico derivatizaci a fragmentačním predikcím.
• Zjednodušený a zrychlený workflow od neřízeného profilování k rutinnímu cílenému screeningu a kvantifikaci pomocí automatického generování TASQ metod.
• Aplikovatelné v metabolomice, environmentálních studiích, potravinářských analýzách a v průmyslové QA/QC tam, kde jsou vzorky derivatizovány.

Omezení:

• Závislost na typu derivatizace — je třeba odpovídajícím způsobem modelovat a validovat in-silico deriváty pro různé derivatizační činidla.
• Potřeba další ověření výsledků experimentálními standardy pro konfirmaci klíčových anotací.
• Systém je prezentován jako výzkumný nástroj (For Research Use Only) a závisí na konkrétním softwaru a hardware dodavatele.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Rozšíření a standardizace in-silico derivatizačních modelů pro širší škálu derivatizačních činidel a analytických tříd.
• Integrace pokročilých algoritmů a strojového učení pro lepší predikci fragmentace a rychlejší filtrování kandidátů.
• Vytváření větších propojených databází obsahujících experimentální a in-silico spektra pro zvýšení shody i u vzácných metabolitů.
• Automatizace kvality dat a kvantitativních workflowů pro robustní aplikace v rutinních laboratořích a regulačních studiích.
• Možnost rozšíření platformy pro jiné hyphenované techniky a ionizační režimy.

Závěr

Prezentované workflow ukazuje, že kombinace CI a EI na GC-ecTOF s podporou in-silico derivatizace a fragmentace poskytuje robustní a praktický přístup pro rozšířené GC-MS analýzy. Metoda zlepšuje schopnost anotovat derivatizované látky bez dostupných standardů, zvyšuje identifikační jistotu využitím ortogonálních signálů a zrychluje přechod k rutinním kvantitativním metodám díky integraci MetaboScape a TASQ. Pro plné nasazení v rutinní praxi bude nezbytné další ověření klíčových anotací experimentálními standardy a rozšiřování in-silico modelů.

Reference

1. NIST. NIST Reference Material 8048 Human Fecal Material — Reference Material Information Sheet. NIST SRM 8048 (informační list k referenčnímu materiálu).
2. Ruttkies C., Schymanski E. L., Wolf S., Hollender J., Neumann S. (2016) MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation. Journal of Cheminformatics, 8:3. DOI: 10.1186/s13321-016-0115-9.