Enzymatic analysis of urea in swimming pool water

Význam tématu

Kontrola obsahu močoviny ve vodě bazénů je klíčová pro zajištění hygieny a bezpečnosti plavců. Organické dusíkaté látky včetně močoviny reagují s volným chlorem za vzniku chlorovaných sloučenin a chloraminů, které představují zdravotní riziko a mohou také sloužit jako živiny pro mikroorganismy. V některých zemích (např. Finsko) existují regulační hranice pro močovinu v bazénové vodě (≤ 0,8 mg/L), což vyžaduje spolehlivé a citlivé analytické metody pro rutinní monitoring.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu bylo ověřit enzymatickou metodu stanovení močoviny v bazénové vodě implementovanou pro automatizované analyzátory Thermo Scientific (Gallery a Aquakem). Studie porovnávala výsledky enzymatické metody s tradiční Koroleffovou metodou (persulfátové mineralizace) a s referenční enzymatickou metodou z externí laboratoře. Hodnoceny byly korelace, opakovatelnost, mez detekce a systematické chyby při nízkých i vyšších koncentracích.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: enzymatická, dvoustupňová reakce využívající ureázu a glutamát dehydrogenázu (GLDH). Princip: ureáza přeměňuje močovinu na ammonium a hydrogenuhličitany; následná reakcí GLDH při přítomnosti NADH probíhá konverze 2-oxoglutarátu a NH4+ na L-glutamát s úbytkem NADH, který se sleduje spektrofotometricky při 340 nm. Výsledné stanovení močoviny je vypočteno jako rozdíl mezi celkovým „amoniem po enzymatické konverzi“ a volným ammoniem měřeným zvlášť.

Postup a příprava vzorků:

• Dechlorace vzorků doporučena (sodný thiosulfát) kvůli interferenci chlóru; v automatizovaných aplikacích byl dechlorinační činidlo dávkován přímo v testflow.
• Analýza do 48 hodin od odběru.
• U automatizovaných protokolů (Aquakem) byly uvedeny objemy a inkubační časy: např. 80 µL vzorku + 3 µL dechlorinačního činidla, poté 40 µL R1, 10 µL R2, inkubace 300 s, blankování, přidání 10 µL R3 a inkubace 900 s; měření při 340 nm.

Kalibrace: výchozí koncentrace 6 mg/L s automatickým ředěním; kalibrační křivka polynomická (u amoniaku i urey).

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Gallery discrete analyzer
• Thermo Scientific Aquakem discrete analyzer
• Fotometrické detektory pracující při 340 nm (pro GLDH) a 660 nm (pro salicylátovou metodu amoniaku)

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a mez detekce:

• Experimentálně stanovená mez detekce byla 0,064 mg/L (na základě 25 opakování kontrolního vzorku 0,1 mg/L s naměřenými hodnotami 0,080–0,130 mg/L).

Opakovatelnost a systematické chyby:

• Pro koncentraci 1 mg/L byla průměrná systematická chyba ~6,52 % (rozsah 0–18 %) při opakovaných měřeních za několik měsíců a přes různé šarže činidel.
• Pro nízkou koncentraci 0,2 mg/L byla průměrná chyba vyšší (~18,13 %), což je vysvětleno tím, že výpočet močoviny závisí na dvou nezávislých měřeních (celkové ammonium po ureáze a volné ammonium), které při nízkých hladinách zvyšují relativní chybu. Navíc je analýza amoniaku citlivá na kontaminaci vzdušným amoniakem.

Korelace metod:

• Dvě enzymatické metody mezi sebou vykazovaly velmi dobrou korelaci (r2 = 0,995).
• Koroleffova metoda vykazovala horší shodu s enzymatickou metodou (r2 ≈ 0,789) a u vzorků s vyšší koncentrací měla tendenci k nižší recovery ve srovnání s enzymatickými výsledky.

Profiency testy:

• Metoda Thermo Scientific dosáhla v externích testech (SYKE) hodnocení "excellent" pro testované vzorky, což posílilo důvěru v přesnost enzymatické metody pro rutinní monitoring.

Další poznámky k chybám: metodika je „vypočítaná“ (rozdílový výsledek), proto kumulace chyb ze dvou měření může vést k vyšší nepřesnosti zejména u nízkých koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy enzymatické metody pro stanovení močoviny v bazénové vodě:

• Vyšší specifičnost pro močovinu oproti persulfátové mineralizaci (Koroleff) a tedy lepší přesnost výsledků, zejména při vyšších koncentracích.
• Nižší mez detekce (až ~0,064 mg/L), vhodné pro dodržování přísných limitů (např. 0,8 mg/L ve Finsku).
• Metodu lze plně automatizovat na diskretních analyzátorech, což zvyšuje kapacitu a efektivitu laboratorního provozu (desítky až stovky výsledků za hodinu podle instrumentu).

Praktické využití:

• Rutinní monitoring kvality bazénové vody v provozech veřejných a soukromých bazénů.
• Podpora rozhodování o úpravě dezinfekce a čištění v závislosti na organické zátěži.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího vývoje a aplikací:

• Dále zlepšit přesnost při nízkých koncentracích optimalizací měření amoniaku, minimalizací kontaminace a zdokonalením výpočtů rozdílových testů.
• Integrace s on-line monitoringem a systémovou automatizací pro kontinuální sledování kvality vody v reálném čase.
• Rozšíření účinných kalibračních protokolů a standardizace mezi laboratořemi (mezinárodní validační studie) pro sjednocení výsledků mezi enzymatickými metodami a tradičními chemickými postupy.
• Vývoj rychlejších reagentů nebo alternativních optických konfigurací ke zkrácení doby inkubace bez snížení přesnosti.

Závěr

Enzymatická metoda stanovení močoviny založená na ureáze a GLDH provedená na automatizovaných diskretních analyzátorech poskytuje lepší specifičnost a obecně vyšší přesnost než tradiční Koroleffova metoda, zejména při vyšších koncentracích. Metoda je vhodná pro rutinní monitoring bazénové vody, dosahuje nízké meze detekce (~0,064 mg/L) a prokázala v externích testech vysokou shodu s referenčními hodnotami. Nevýhodou jsou větší relativní chyby na nízkých koncentracích kvůli konstrukci vypočítaného výsledku (dva nezávislé chemické stepy) a citlivosti analýzy amoniaku na kontaminaci.

Reference

1. Wojtowicz J. Cyanuric and Isocyanuric Acids. In: Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons; 2000.
2. Koroleff F. Determination of Urea. In: Methods of Seawater Analysis. Grasshoff K., Erhardt M., Kremling K. (eds.). Verlag Chemie, Weinheim; 1983. p. 158–162.
3. SYKE (Finnish Environment Institute). Swimming Pool Water Report; 2013.