An Integrated Software Ecosystem for End-to-End Oligonucleotides DataAcquisition, Analysis, and Reporting

Význam tématu

Charakterizace syntetických oligonukleotidů (siRNA, ASO, gRNA, aptamery) je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality moderních oligonukleotidových léčiv. Kvalitní a úplná analýza zahrnuje potvrzení sekvence i kvantifikaci souvisejících nečistot, což je časově i analyticky náročné. Integrované softwarové a hardwarové řešení umožňuje zefektivnit tok od akvizice dat až po automatické reportování, zvyšuje průchodnost laboratorních postupů a snižuje riziko lidské chyby.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a demonstrovat end-to-end software ekosystém pro analýzu siRNA, schopný automatizovat akvizici dat, zpracování a generování reportů včetně potvrzení sekvence a profilování nečistot. Testování bylo provedeno na dvou modelových siRNA (inclisiran, givosiran) v denaturovaných i nendenaturovaných formách za použití ion-parního RP-LC spojeného s Q-TOF MS.

Použitá metodika

Metodika kombinuje ion-pairing reverzní fázi (IP-RP) HPLC s DAD (260 nm) a vysokorozlišujícím Q-TOF MS. Pro separaci byl aplikován bifázový gradient založený na kombinaci 15 mM triethylaminu (TEA) a 50 mM HFIP ve vodě (mobilní fáze A) a methanolu (mobilní fáze B). Analýzy probíhaly pro oba stavy (denaturovaný/nendenaturovaný) a zahrnovaly jak průtokovou chromatografii, tak cílené MS/MS pro potvrzení sekvence.

Použitá instrumentace

• Kolona: Agilent Altura Oligo HPH-C18, 2.1 × 50 mm, 2.7 µm.
• LC podmínky: průtok 0.4 mL/min, injekční objem 1 µL, zvýšená teplota kolony pro určité experimenty (až 65 °C).
• Detekce: DAD při 260 nm pro sledování oligonukleotidů.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6545XT Q-TOF, režim MS a cílené MS/MS; rozsah m/z ~400–3200, akvizice MS i rychlejší MS/MS pro mapování fragmentů.
• Softwarové prostředí: klient–server architektura zahrnující BioConfirm (moduly pro sekvenční potvrzení, profily modifikací a generování reportů) s připravenými šablonami a nástroji pro automatické zpracování.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza obou siRNA ukázala, že systém zvládne jak denaturované, tak nendenaturované formy; chromatogramy UV a celkové iontové chromatogramy byly získány a dekonvoluované hmotnostní spektra prokázala charakteristické iontové signatury obou molekul. Pro inclisiran bylo dosaženo 100% pokrytí sekvence pro obě vlákna (antisense i sense) pomocí cíleného MS/MS zaměřeného na vybrané nabité stavy (např. −10, −11 antisense; −9, −13 sense). Automatizované sekvence experimentů (task/wait/sample parameters) umožnily bezobslužný chod acizice a následné zpracování dat, včetně generování hotových reportů. Ukázalo se, že kombinace softwaru, vhodného hardwaru a spotřebního materiálu (sloučeniny pro LC/MS, filtry, vialy) poskytuje robustní workflow pro komplexní profilování oligonukleotidů.

Přínosy a praktické využití metody

• End-to-end automatizace: minimalizace zásahů obsluhy a zvýšení průchodnosti laboratoře.
• Komplexní analýza: simultánní potvrzení sekvence a profilování nečistot v jednom workflow.
• Reprodukovatelnost a srovnatelnost výsledků díky předdefinovaným metodám a reportovacím šablonám.
• Škálovatelnost: možnost nepřetržitého provozu po několik dní s plánovanými úkony (kalibrace, vypnutí/zapnutí modulů).
• Praktické uplatnění v R&D a v QC prostředí farmaceutického průmyslu pro ověřování produktů a kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikací zahrnují:

• Rozšíření kompatibility softwaru s dalšími typy hmotnostních spektrometrů a LC systémů pro širší adopci.
• Integrace strojového učení pro urychlení interpretace spekter a identifikaci vzácných nebo neočekávaných modifikací.
• Automatizované QC pipeline splňující regulatorní požadavky (audit-traily, validace metodiky).
• Adaptace pro větší nebo méně konvenční oligonukleotidy (chemicky modifikované, konjugáty), včetně optimalizace separačních podmínek.
• Real-time monitorování a prediktivní plánování běhů za účelem maximalizace využití přístrojů.

Závěr

Prezentovaná integrační platforma propojuje instrumentální akvizici, sofistikované zpracování dat a generování reportů do jednotného, automatizovatelného workflow vhodného pro analýzu siRNA. Demonstrace na inclisiranu a givosiranu prokázala schopnost dosáhnout kompletního pokrytí sekvence a provádět detailní profilování nečistot, čímž řešení nabízí praktickou a škálovatelnou cestu pro R&D a QC v oblasti oligonukleotidových terapií.

Reference

• Poster Reprint ASMS 2026, WP 589: Guannan Li, Stephen Sciuto, Jordy Hsiao, Linfeng Wu, David Wong, Ruoji Luo, Agilent Technologies, Santa Clara, California. Publikováno 10. června 2026.