Quantitation of N-Nitroso Duloxetine N-Nitrosamine Drug Substance Related Impurities (NDSRI) in API and Formulation by 6475 LC/TQ

Význam tématu

Analýza nitrosaminových nečistot v léčivých látkách je kritická z hlediska bezpečnosti pacientů i regulační shody. N-nitrosaminy (NDSRI) jsou vysoce relevantní i v stopových koncentracích kvůli jejich karcinogenitě; proto jsou požadovány metody s velmi nízkou hranicí detekce a vysokou selektivitou. LC/MS/MS v režimu MRM představuje standardní přístup pro kvantifikaci takto nízko koncentrovaných cílových sloučenin v komplexních matricích API a finálních forem.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout citlivou, selektivní a reprodukovatelnou metodu pro kvantifikaci N-nitroso duloxetinu v surovém duloxetin-hydrochloridu (API) a v pelletových formulacích. Metoda byla validována přes linearitu, přesnost (recovery), opakovatelnost při LOQ a limity detekce (LOD/LOQ) a optimalizována tak, aby minimalizovala matricové efekty vysoké koncentrace API.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: reverzně-fázová LC separace následovaná tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/TQ) v režimu multiple reaction monitoring (MRM). Kalibrační rozsah: 0,5–40 ng/mL (absolutní koncentrace standardu). Váhování: 1/x pro kalibrační křivku.

Vzorky: analytický referenční standard N-nitroso duloxetinu, API duloxetin HCl, placebo a pelletové formulace dodané farmaceutickou společností.

Klíčové chromatografické parametry a složení mobilních fází:

• Kolona: Poroshell HPH C18, 4.6 × 150 mm, 2.7 µm.
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě.
• Mobilní fáze B: methanol (100 %).
• Průtok: 0,5 mL/min; injekční objem: 8 µL; teplota kolony: 40 °C; chlazení vzorku: 5 °C.
• Gradient: přechod z převážně vodné fáze na vysoký organický obsah a návrat pro reekvilibraci; doba analýzy ~18 min, mezi analytem a API byla dosažena chromatografická separace ~2,5 min.

Hmotnostní spektrometrie a ionizace:

• Instrument: Agilent 6475A Triple Quadrupole LC/TQ.
• Ionizátor: APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization), p/n G1947B.
• Parametry: teplota plynu 300 °C, průtok plynu 7 L/min, nebulizér ~45 psi, teplota vaporizéru 350 °C, kapilární napětí 2000 V, corona current 6 (uvedeno v sestavě).
• MRM přechod zmíněný pro N‑nitroso duloxetin: 183 → 123 (jako příklad selektivního přechodu).
• Do MS byl nasměrován pouze frakční výtah eluátu pomocí diverter ventilu, aby se zabránilo zatížení detektoru vysokou koncentrací API.

Hlavní výsledky a diskuse

Separační výkon a potlačení matice:
Po rozsáhlém vývoji metod bylo dosaženo oddělení analytu od hlavního API přibližně o 2,5 minuty, což významně snižuje matričné potlačení signálu. Implementace diverter ventilu chránila hmotnostní spektrometr před vysokým zatížením API a přispěla k opakovatelnosti měření.

Citlivost a linearita:
Limit detekce (LOD) byl stanoven na 0,5 ng/mL (0,5 ppb) a limit kvantifikace (LOQ) na 2 ng/mL (2 ppb). Kalibrační křivka z 7 bodů v rozsahu 0,5–40 ng/mL vykázala výbornou linearitu s R² > 0,99 při vážení 1/x.

Přesnost a recovery:
U API byly uvedené recovery v rozmezí přibližně 92–99 %, zatímco v pelletových formulacích se pohybovaly mezi 109–116 % při úrovních LOQ, 100 % specifikace a 200 % specifikace. %RSD na úrovni LOD a specifikace byly pod 5 %, což potvrzuje dobrou preciznost metody.

S/N a kvalita signálu:
Metoda dosáhla vhodných poměrů signálu k šumu na úrovních LOD a LOQ (viz údaje o S/N), což podporuje schopnost spolehlivě detekovat a kvantifikovat analyty na stopových hladinách.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Metoda umožňuje rutinní screening a kvantifikaci N‑nitroso duloxetinu v API a finálních formulacích s citlivostí odpovídající regulačním požadavkům.
• Vysoká selektivita MRM a chromatografická separace snižují riziko falešně pozitivních/negativních výsledků způsobených matricemi.
• Implementace diverter ventilu a optimalizované MS parametry prodlužují životnost detektoru a zlepšují robustnost provozu při analýze vzorků s vysokým obsahem API.

Uplatnění v praxi:
Metodu lze použít k podpoře kontrol kvality při vývoji a výrobě duloxetinu, při uvolňování šarží a při šetření(sledování) nečistot souvisejících s N‑nitrosaminy v souladu s moderními evropskými a americkými doporučeními.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a možnosti rozšíření:

• Rozšíření panelu sledovaných NDSRI pro širší spektrum struktur souvisejících s duloxetinem a jinými API pomocí více MRM přechodů.
• Automatizace přípravy vzorků a vyšší míra multiplexace pro zrychlení rutinních analýz v QA/QC laboratořích.
• Integrace derivatizačních kroků nebo alternativních ionizačních režimů pro zvýšení citlivosti u nestejně ionizovatelných nitrosaminů.
• Další práce na minimalizaci matričných efektů a standardizace metodiky napříč výrobci a laboratořemi pro porovnatelnost dat.

Závěr

Byla vyvinuta a ověřena robustní LC/MS/MS metoda (Agilent 6475A LC/TQ, APCI) pro stanovení N‑nitroso duloxetinu v API a pelletových formulacích s LOD 0,5 ng/mL a LOQ 2 ng/mL. Metoda prokázala excelentní linearitu (R² > 0,99), dobrou přesnost a reprodukovatelnost (%RSD < 5 %) a přijatelné recovery v testovaných matricích. Díky vysoké selektivitě a ochraně MS (diverter) je metoda vhodná pro rutinní kontrolu kvality a regulační účely.

Použitá instrumentace

• Agilent 6475A Triple Quadrupole LC/TQ se zdrojem APCI (p/n G1947B).
• Chromatografická kolona Poroshell HPH C18, 4.6 × 150 mm, 2.7 µm (Agilent, part no. 693975-702).
• Mobilní fáze: 0,1 % formiová (mravenčí) kyselina ve vodě a methanol (MS grade).
• Další spotřební: MS grade methanol, formic acid, MS grade voda.

Reference

1. U.S. Food and Drug Administration. FDA updates and press announcements — angiotensin II receptor blocker (ARB) recalls (valsartan, losartan) — information on nitrosamine impurities. FDA press materials.
2. European Medicines Agency. EMA guideline EMA/409815/2020 Rev.23; effective from 10 October 2025.
3. U.S. Food and Drug Administration. Guidance document on Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities. Docket Number: FDA-2020-D-1530, 04 Aug 2023.