Ultra-Trace Quantification of N-Nitroso-desmethyl-sumatriptan with Interference Resolution Using LC–TQ

Význam tématu

Analýza nitrosaminů v léčivých látkách je kritická z hlediska toxikologie a regulačních požadavků, neboť některé nitrosaminy jsou genotoxické a musí být sledovány na velmi nízkých úrovních. N-nitroso-desmethyl-sumatriptan (NDSRI) je N-nitrosamin vznikající ze sumatriptanu a je klasifikován jako Category 1 nitrosamin; jeho specifikované maximum je 0,0428 ppm vůči API. Spolehlivá kvantifikace v ultra-sledovatelných koncentracích je proto nezbytná pro QA/QC ve výrobě a při uvolňování šarží.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout citlivou, přesnou a opakovatelnou LC–TQ metodu pro kvantifikaci N-nitroso-desmethyl-sumatriptanu v práškovém sumatriptan succinátu tak, aby LOQ leželo výrazně pod specifikační mezí 0,0428 ppm. Studie hodnotila linearitu, přesnost (recovery), opakovatelnost (RSD) a schopnost rozlišit analyt od interferencí přítomných v matrici API.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda:

• Příprava vzorků a standardů: methanol:voda (1:1, v/v).
• Cílový rozsah kalibrace: 0,00214–0,1 ppm vůči API.
• Cílové LOQ: ~0,00428 ppm (tj. přibližně 10 % hodnoty specifikace), kalibrační linearita a nízké RSD.

Instrumentace:

• UHPLC: Agilent 1290 Infinity III.
• Hmotnostní analyzátor: Agilent 6495D Triple Quadrupole (LC/TQ) v MRM režimu, ESI-AJS pozitivní ionizace.
• Kolona: Poroshell 120 EC-C18, 3.0×150 mm, 2.7 µm, teplota 40 °C.
• Autosampler: 15 µL, 8 °C; průtok 0,4 mL·min⁻¹.
• Mobilní fáze: A = 2 mM amonný formiát + 0,1 % formiové kyseliny ve vodě; B = 0,1 % formiové kyseliny v 9:1 acetonitril:voda. Gradient: start 90 % A/10 % B, progresivně ke 70/30 at 6–10 min, do 10/90 mezi 11–13 min a návrat na počátek v 14 min.
• Detekce: UV 228 nm pro API, MRM pro NDSRI; diverter ventil směrující průtok do MS mezi 8–12 min.
• MRM přechody (příklad): Prekursor m/z 311.1 → produkty m/z 143; 186.1; 216.1 s optimalizovanými CE (33, 20, 6).
• Parametry ionizace a plynů: drying gas 17 L·min⁻¹ (250 °C), sheath gas 12 L·min⁻¹ (350 °C), nebulizér 55 psi, capillary 3500 V, nozzle 500 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie a separace:

• Sumatriptan API se elutoval přibližně v 2,3 min; NDSRI se elutoval výrazně později (~8,8 min), což poskytlo chromatografickou separaci API a sledované nečistoty.

Citlivost, linearita a opakovatelnost:

• Kalibrační rozsah 0,00214–0,1 ppm vykázal vynikající linearitu s r² = 0,9998.
• Metoda dosáhla LOQ přibližně 0,00428 ppm (tj. ~10 % specifikace), což odpovídá cíli extrémně nízké detekovatelnosti.
• Opakovatelnost: RSD pro standardy a vzorky spiked na úrovni specifikace (0,0428 ppm) byly nízké — např. 1,3 % pro standard a 2,01 % pro spiked vzorek. Na úrovni LOQ byly RSD 0,64 % (standard) a 1,3 % (spiked).

Recovery a detekce v matrici:

• Recovery v testovaných spikovaných vzorcích byla ~95 % (95,5 % při LOQ a 95,2 % při úrovni specifikace), což indikuje dobrou přesnost metody v matrici API.
• Nezpracované repliky API (10 mg·mL⁻¹) měly obsah NDSRI pod LOQ, tedy nižší než detekční hranice metody.

Interferenční rozlišení:

• Kombinace vhodné chromatografie (oddělení retencí) a MRM selektivity na triple quadrupolu umožnila potlačit vliv interferencí matricového původu a dosáhnout spolehlivé kvantifikace na stopových úrovních.

Přínosy a praktické využití metody

• Uvedená metoda poskytuje analytickým laboratořím robustní postup pro rutinní kontrolu nitrosaminové nečistoty NDSRI v sumatriptan succinátu se sensitivní LOQ pod regulačním limitem.
• Vysoká selektivita MRM a chromatografická separace umožňují použití metody v kontrolních laboratořích farmaceutických výroben pro uvolňování šarží a stabilitní studie.
• Metoda je vhodná i pro sledování trendů tvorby nitrosaminů v procesním vývoji a při ověřování čistoty surovin.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření sledovaných nitrosaminů: zavedení multiplexních metod sledujících širší panel NDSRI ve více API současně.
• Automatizace a inkluze v řízených QA/QC workflow: plná integrace přípravy vzorků a výstupů do LIMS pro rychlé uvolňování šarží.
• Využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro dodatečnou identifikaci neznámých interferencí a potvrzení struktur nitrosaminů.
• Metody v oblasti izotopově značených interních standardů a stable isotope dilution pro ještě lepší kvantifikaci v náročných matricích.
• Standardizace postupů a mezilaboratorní porovnání pro zvýšení spolehlivosti dat v regulovaném prostředí.

Závěr

Byla vyvinuta citlivá a reprodukovatelná LC–TQ metoda pro kvantifikaci N-nitroso-desmethyl-sumatriptanu v sumatriptan succinátu. Metoda dosahuje LOQ přibližně 0,00428 ppm, vykazuje vynikající linearitu (r² = 0,9998), nízké RSD a recovery ~95 % ve spikovaných vzorcích. Chromatografická separace mezi API a NDSRI kombinovaná s MRM detekcí poskytuje účinné řešení interferencí a metodika je vhodná pro rutinní QA/QC použití v průmyslovém prostředí.

Reference

1. U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: CDER Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits. FDA regulační dokumentace týkající se přípustných hladin nitrosaminů.
2. Agilent Technologies. Aplikace k analýze N‑nitroso nečistot pomocí 6495 triple quadrupole LC/MS, dokumentace a aplikační poznámky Agilent Technologies.