Quantitation of N-Nitroso-Desmethyl- Diltiazem, an NDSRI Impurity of Diltiazem Hydrochloride in Drug Product Using LCMS/ MS

Význam tématu

N-nitrosaminy patří mezi klíčové bezpečnostní rizika v léčivých přípravcích od roku 2018 vzhledem k jejich potenciálním mutagenním a karcinogenním vlastnostem. Regulátoři stanovili postupy pro hodnocení rizika, kontrolu a analytické monitorování těchto nečistot včetně NDSRI (nitrosaminy příbuzné s API). Kvantifikace N-nitroso-desmethyl-diltiazemu (NDD) v konečných tabletách diltiazem-hydrochloridu je proto nutná pro zajištění shody s limitními hodnotami a bezpečnosti pacientů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout vysoce citlivou a robustní UPLC-ESI-MS/MS metodu pro kvantifikaci NDD v tabletkových formulacích diltiazemu tak, aby detekční a kvantifikační limity překračovaly požadavky regulátorů (původně 0,05 ppm s 10% LOQ 0,005 ppm; nově přepočtený limit 0,185 ppm s 10% cílem 0,0185 ppm). Metoda byla validována lineární oblastí, přesností navážení, návratností ve vzorkovém matrici a opakovatelností.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Plus (Waters)
• ACQUITY UPLC PDA detektor
• Xevo TQ-S micro Tandem Quadrupole Mass Spectrometer (ESI+, Waters)
• Quaternary Solvent Manager, Sample Manager s Flow‑Through Needle
• Kolona: ACQUITY UPLC HSS T3, 1.8 µm, 3.0 × 100 mm
• Informační/kvantifikační software: waters_connect for Quantitation (MS Quan)

Použitá metodika

Metoda využívá reverzní fázi UPLC s mobilní fází A: 0,1 % octové kyseliny ve vodě (LC/MS kvalita) a B: acetonitril (LC/MS kvalita). Teplota kolony 45 °C, objem injekce 2,0 µL, teplota vzorku 10 °C. Ionizace v MS: ESI pozitivní režim; optimalizované MRM přechody pro izomery NDD získané automatickým laděním. Data akvizice a zpracování spravovala platforma waters_connect s automatickým generováním metod, pravidly pro hodnocení kalibrací a podporou 21 CFR Part 11.

Postup přípravy vzorku

Tableta (120 mg) byla rozdrcena, suspendována tak, aby koncentrace API činila 40 mg/mL, vortexována 3 minuty, centrifugována (3000 rcf) a filtrát přes 0,20 µm PVDF převeden do autosampler lahvičky. Kalibrační řada z autentického standardu NDD: 0,01–10 ng/mL (0,00025–0,25 ppm ekvivalent metody). Interní standard nebyl použit.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah: 0,01–10 ng/mL s R² > 0,999 (1/x vážená regrese), tedy minimálně tři dekády lineárního rozsahu.
• Citlivost: metoda dosáhla LOQ pod 10 % z původně přísnějšího regulačního limitu 0,05 ppm (cílové 0,005 ppm metody) — standard 0,01 ng/mL vykazoval uspokojivé S/N.
• Chromatografie: bazálně rozlišené píky diltiazemu (tR ≈ 8,5 min) a dvou izomerů NDD (tR ≈ 11,6 a 12,1 min), což minimalizuje matrické efekty; použití RADAR skenu poskytlo doplňující kvalitativní informace o eluci API.
• Opakovatelnost: při úrovni reprezentující 10 % prahu (0,2 ng/mL, ekvivalent 0,005 ppm) byla %RSD oblasti píku ~2,9–3,1 % (n = 6).
• Návratnost ve finálním tabletovém matrice: pro čtyři testované hladiny (odpovídající 10–150 % prahu) byly průměrné recoveries 90,7–106,6 % s %RSD < 10 %.
• Detekce v reálných vzorcích: v některých extraktech byla detekována hladina NDD překračující nastavený limit a software ji automaticky označil (flagging) s přepočtem na ppm vzhledem ke koncentraci API ve vzorku (40 mg/mL).
• Software a zpracování: waters_connect / MS Quan umožnil automatizované ladění MRM, definici akceptačních pravidel (např. tolerance kalibračních bodů, R²), výpočty ppm a evidenci (audit trail), což zvyšuje efektivitu a souladu s regulačním rámcem.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda poskytuje dostatečnou citlivost pro splnění aktuálních i dřívějších přísnějších regulačních požadavků na NDD, čímž umožňuje kontrolu kvality bez nutnosti doplňkového vydávání šarží.
• Chromatografické rozlišení API a izomerů NDD zajišťuje přesnou kvantifikaci i v přítomnosti vysoké koncentrace API.
• Integrované softwarové workflow zrychluje vývoj metody, akvizici dat, vyhodnocení a reporting se zabudovanými pravidly akceptace výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvyšování automatizace a integrace detekčních limitů přímo v prostředí LIMS/informatiky pro rychlejší rozhodování o uvolnění šarží.
• Rozšíření metody o stabilní izotopově značené interní standardy pro ještě lepší kompenzaci matrických vlivů a přesnost kvantifikace.
• Adaptace pracovního postupu na jiné NDSRI struktury s minimálními úpravami MRM přechodů a chromatografie.
• Využití vysokorozlišovací MS pro nejasné nebo nově vzniklé nitrosaminy, kde by potvrdil strukturu a pomohl při čtení návratností z reálných vzorků.

Závěr

Vyvinutá UPLC-ESI-MS/MS metoda na přístroji Xevo TQ‑S micro poskytuje citlivé, přesné a reprodukovatelné kvantifikace N-nitroso-desmethyl-diltiazemu v konečném tabletovém přípravku. Metoda překračuje požadavky kladené na LOQ (10 % z předepsaných prahů včetně přísnějších historických limitů), vykazuje dobrou lineárnost, opakovatelnost a návratnost ve vzorkovém matrice. Integrované softwarové nástroje umožňují robustní zpracování dat, automatické vyhodnocení a podporu souladu s požadavky na integritu dat.

Reference

1. Moser J., Schlingemann J., Saal C. N-Nitrosamines Impurities in Pharmaceuticals; The Abrupt Challenges that Resulted, the Evolving Science, and the Regulatory Framework. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2023;112(5):1161–1162. DOI: 10.1016/j.xphs.2023.01.016.
2. Teasdale A., Moser J., Ford J.G., Creasy J. N‑Nitrosamines. In: Mutagenic Impurities. Teasdale A., editor. Wiley; 2021. p. 269–320.
3. Bharate S.S. Critical Analysis of Drug Product Recalls due to Nitrosamine Impurities. Journal of Medicinal Chemistry. 2021;64(6):2923–2936. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c02120.
4. Holzgrabe U. Nitrosated Active Pharmaceutical Ingredients - Lessons Learned? Journal of Pharmaceutical Sciences. 2023;112(5):1210–1215. DOI: 10.1016/j.xphs.2023.01.021.
5. Schlingemann J., et al. The Landscape of Potential Small and Drug Substance Related Nitrosamines in Pharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2023;112(5):1287–1304.
6. Montesano R., Hall J. Nitrosamine Metabolism and Carcinogenesis. In: Mutation, Cancer, and Malformation. Springer US; 1984. p. 447–464.
7. FDA. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs. Guidance document. 2020–2023 (různá vydání).
8. EMA. Scientific review on the risk of nitrosamine impurities in human medicines. European Medicines Agency, post-authorisation overview.
9. ICH M7(R2) Guideline on assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk.
10. EMA. Nitrosamine impurities: guidance for marketing authorisation holders – Appendix 1: Acceptable intakes established for N‑nitrosamines.
11. FDA CDER. Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits. Agency guidance and compound lists.
12. Mandapaka M.K., Boddu V. A Simple and Rapid Analytical Method to Detect and Quantify the N‑Nitroso Desmethyl Diltiazem Impurity by LC‑MS/MS in Diltiazem Hydrochloride. Separation Science Plus. 2025;8(5):e70065.
13. CDER. Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits (compound-specific listings).
14. Ishii K., et al. Direct chromatographic resolution of four optical isomers of diltiazem hydrochloride on a Chiralcel OF column. Journal of Chromatography A. 1994;686(1):93–100.
15. Technical Guide to the Stereoisomers of Diltiazem: A Comparative Analysis of cis-(2S,3S)-Diltiazem and (2R-trans)-Diltiazem Hydrochloride. BenchChem technical guide.