Identify Optimal Biologic Candidates: Low Volume, Early Stage Developability Assessment with Aura PTx System

Význam tématu

Posuzování "developability" biologických léčiv v raných fázích vývoje je klíčové pro výběr kandidátů, kteří jsou nejen účinní, ale i vyrobitelní a stabilní během skladování a zpracování. Subviditní částice (≥2 µm) jsou považovány za kritický atribut kvality, neboť zvyšují riziko imunogenicity a mohou negativně ovlivnit dávkování a životnost produktu. Tradiční metody pro detekci subviditních částic vyžadují větší objemy vzorku, což omezuje jejich použití při omezené dostupnosti materiálu. Studie popisuje, jak platforma Aura PTx umožňuje přímou, nízkovolumetrickou a vysokopropustnou analýzu subviditních částic, čímž podporuje včasné, datově podložené rozhodování při výběru kandidátů a optimalizaci formulací.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat stabilitu tří proteinových kandidátů (A, B, C) v sadě 14 průmyslově relevantních pufrů a excipientů (acetát, citrát, tris, glycin a varianty pH/NaCl) při nízké koncentraci (0,1 mg/mL) a s minimální spotřebou vzorku. Studie měla demonstrovat schopnost Aura PTx provést kompletní screening (168 vzorků ve čtyřnásobku) za méně než tři hodiny a identifikovat nejstabilnější kombinace proteinu a prostředí na základě počtu subviditních částic (counts/mL, ECD ≥2 µm). Zároveň byla cílem ukázat možnosti analýzy na úrovni jednotlivých částic pomocí fluorescenční membránové mikroskopie (FMM) s barvením Thioflavin T pro diferenciaci proteinových agregátů.

Použitá instrumentace

• Aura PTx System (Aura platform) – primární přístroj pro nízkovolumetrickou analýzu subviditních částic a obrazování.
• Aura+ System – uveden jako součást platformy (rozšíření možností Aura řady).
• Particle Vue Software – softwarové prostředí pro zobrazení galerie a analýzu jednotlivých částic.
• Fluorescenční barvivo Thioflavin T (ThT) – použit pro identifikaci proteinových agregátů v režimu FMM.

Použitá metodika

• Vzorky: tři proteiny formulované z lyofilizovaného prášku do 0,1 mg/mL v 14 různých pufrech/excipientních matricích.
• Objem a replikace: experimenty proběhly v kvadruplicate s 40 µL na jamku; platforma je však schopná pracovat s objemy až do 5 µL pro některé režimy.
• Měřená veličina: kvantifikace subviditních částic v counts/mL pro ECD ≥2 µm; výstupy doplněny obrazy a FMM signálem pro jednotlivé částice.
• Časová náročnost: kompletní sweep 168 jamek zabral méně než 3 hodiny.
• Analýza dat: hodnocení variability (%CV), porovnání mezi pufry a kandidáty, hodnocení morfologie a fluorescence částic pro určení proteinové povahy agregátů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Obecná robustnost: většina měření vykazovala %CV pod 10 %, což příznivě dokládá opakovatelnost při nízkých objemech vzorku.
• Acetátové pufry: Protein C vykazoval nejvyšší počet částic (nad ~45 000 counts/mL), Protein A se pohyboval kolem ~35 000 counts/mL a Protein B byl podobně stabilní jako A s výjimkou variant bez NaCl. Protein B měl nejlepší výkon v jedné acetátové podmínce (buffer #2).
• Citrátové pufry: pořadí se změnilo — Protein A byl nejstabilnější, zatímco Protein B vykazoval 4–425× více agregátů než A a 2–30× více než C. Protein C tvořil 2–14× více částic než A.
• Tris a glycinové pufry: Protein B byl nejméně stabilní, s hodnotami přes 2 miliony counts/mL v některých podmínkách; B tvořil 76–166× více částic než A a 16–58× více než C. Protein C byl 3–5× méně stabilní než A. Celkově A stabilní v širokém spektru alkalických/aqua podmínek.
• Celkové pořadí stability: Protein A = nejstabilnější; Protein C = střední; Protein B = nejméně stabilní. Poznámka: vyhodnocení pouze v acetátu by mylně favorizovalo B jako dobrého kandidáta — celoplošné testování ukázalo jeho vysokou nestabilitu v jiných pufrech.
• Analýza na úrovni jednotlivých částic: FMM s ThT prokázala silnou fluorescenci u částic Proteinu B v glycinovém pufru, což indikuje proteinovou povahu agregátů a jejich hydrofobní charakter. Morfologie kulovitých částic s ThT pozitivitou naznačuje přítomnost fibrilárních/kompaktních hydrofobních agregátů.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje časné a přímé měření subviditních částic při velmi omezených objemech vzorku, což zkracuje a zpřesňuje fázi kandidátního výběru.
• Vysoká propustnost a nízká spotřeba vzorku umožňují rozsáhlé maticové testování pH, soli a excipientů, čímž se minimalizuje riziko, že kandidát postoupí do nákladného stupně vývoje s skrytými stabilitními problémy.
• FMM a obrazová analýza přidávají mechanistickou informaci — rozlišení proteinových vs. neproteinových částic a informace o morfologii agregátů usnadňují návrhy formulací a strategie mitigace degradace.
• Data jsou dostatečně robustní pro rozhodování o pořadí kandidátů před rozsáhlými fyzikálními a biologickými testy, což šetří čas a náklady při scale-upu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace výsledků nízkovolumetrických screeningů s ortogonálními technikami (SEC, DLS, DSC) a in-silico predikcemi stability pro komplexní developability profiling.
• Automatizace a škálování workflow pro větší knihovny kandidátů, včetně aplikace strojového učení ke zlepšení prediktivity na základě obrazových a kvantitativních dat.
• Rozšíření aplikace na různé biologické modality (monoklonální protilátky, konjugáty, peptidy, vektorové systémy) a na hodnocení vlivu výrobních stresů (freeze/thaw, TFF, viral clearance pH kroky).
• Postupná akceptace nízkovolumetrických, obrazových metod regulačními orgány jako doplňku ke standardním metodám kontroly kvality.

Závěr

Aura PTx platforma umožňuje rychlé, nízkovolumetrické a robustní hodnocení subviditních částic, které je klíčové pro včasný výběr biologických kandidátů a optimalizaci formulací. Studie ukázala, že komplexní bufferový screening může zásadně změnit pořadí vhodnosti kandidátů — v prezentovaném datasetu byl nejstabilnějším kandidátem Protein A, zatímco Protein B vykazoval silnou závislost na pufru a v některých podmínkách extrémní agregaci. Kombinace kvantitativních měření s obrazovou a fluorescenční analýzou poskytuje mechanistické poznatky užitečné pro snižování rizik během vývoje a scale-upu.

Reference

1. Lobo SA et al. Stability Liabilities of Biotherapeutic Proteins: Early Assessment As Mitigation Strategy. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 192:113650, 2021.
2. Garripelli VK, Wu Z, Gupta S. Developability Assessment for Monoclonal Antibody Drug Candidates: A Case Study. Pharmaceutical Development and Technology. 26(1):11–20, 2021.
3. Carpenter JF et al. Overlooking Subvisible Particles in Therapeutic Protein Products: Gaps That May Compromise Product Quality. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98(4):1201–1205.