High-Throughput Detection of Degraded Polysorbate in Biological Formulations with FMM

Význam tématu

Biologické lékové formy musí být bez viditelných a subviditelných částic, aby byla zajištěna jejich bezpečnost, účinnost a stabilita při skladování. Degradace povrchově aktivních látek, jako jsou polysorbaty, vede k tvorbě volných mastných kyselin, které se srážejí ve formě subviditelných částic. Vzhledem k tomu, že polysorbaty se vyskytují ve více než 70 % parenterálních biologik, je monitorování jejich degradace klíčové pro QC i vývoj nových přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout vysoko propustnou (high-throughput), citlivou a specifickou metodu pro detekci degradovaných polysorbitů ve formě volných mastných kyselin (FFA) v proteinových formulacích. Představená Aura™ polysorbitová degradace assay využívá fluorescenční membránovou mikroskopii (FMM) na systémech Aura PTx a Aura+ k rychlému zobrazení, počítání, velikostní analýze a identifikaci částic pomocí selektivních fluorescenčních barviv.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu barviva BODIPY FL C16 byla postupně připravena 100 µM roztoková koncentrace ve fosfátovém pufru. Vzorky (5 µL–10 mL) se filtrováním nanesly na pozadím obarvenou membránu. Následovalo snímání v světlém poli pro celkové počty částic a poté fluorescenční kanál FL2 (ex 482/35 nm, em 524/24 nm) pro specifickou detekci mastných kyselin. V případě potřeby se paralelně aplikovalo barvivo thioflavin T pro identifikaci proteinových agregátů ve fluorescenčním kanálu FL1.

Hlavní výsledky a diskuse

Morfologická analýza odhalila specifické tvary FFA částic: velké nepravidelné shluky laurové kyseliny, oválné částice myristové kyseliny a fibrilární formy palmitové kyseliny. Účinnost barvení BODIPY FL C16 dosahovala až 73 % u směsi tří mastných kyselin (3FFA) oproti 6 % u negativního kontrolního vzorku s IgG. Detekční limity (LOD) FFA ve směsi s 0,049 mg/mL IgG byly zjištěny na 9,38 µM laurové kyseliny (>2183 counts/mL) a kvantitační limity (LOQ) na 18,75 µM (>2976 counts/mL). Lineární vztah mezi logaritmem počtu fluorescenčních částic a koncentrací mastné kyseliny dosáhl R2 = 0,9864.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a specificita pro volné mastné kyseliny
• Nízký objem vzorku od 5 µL
• Rychlá analýza 96 vzorků za několik hodin
• Možnost současné detekce proteinových agregátů a excipient degradace
• Vizualizace a verifikace částic na jednom snímku

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na polysorbát 80 a jiné excipienty
• Integrace s automatizovanými linkami pro procesní monitoring
• Kombinace s Ramanovou spektroskopií či dalšími technikami pro hloubkovou charakterizaci částic
• Vývoj multimodálních assay pro komplexní QC biologik

Závěr

Aura polysorbitová degradace assay na systémech Aura PTx a Aura+ nabízí robustní, rychlou a vysoce citlivou metodu pro detekci a kvantifikaci volných mastných kyselin v biologických formulacích. Metoda umožňuje spolehlivé rozlišení jednotlivých typů FFA podle morfologie a intenzity fluorescence a splňuje požadavky na QC a vývoj moderních biologických léčiv.

Reference

• Vaclaw C. et al., Impact of Polysorbate 80 Grade on the Interfacial Properties and Interfacial Stress Induced Subvisible Particle Formation in Monoclonal Antibodies. J Pharm Sci. 2020, 110(2):746–759.
• Dwivedi M. et al., Acidic and Alkaline Hydrolysis of Polysorbates Under Aqueous Conditions. Eur J Pharm Sci. 2020, 144:105211.
• Doshi N. et al., Understanding Particle Formation: Solubility of Free Fatty Acids as Polysorbate 20 Degradation Byproducts in Therapeutic Monoclonal Antibody Formulations. Mol Pharm. 2015, 12(11):3792–3804.
• Glücklich N. et al., An In-Depth Examination of Fatty Acid Solubility Limits in Biotherapeutic Protein Formulations Containing Polysorbate 20 and Polysorbate 80. Int J Pharm. 2020, 591:119934.
• Saggu M. et al., Identification of Subvisible Particles in Biopharmaceutical Formulations Using Raman Spectroscopy Provides Insight Into Polysorbate 20 Degradation Pathway. Pharm Res. 2015, 32(9):2877–2888.
• Doshi N. et al., Improving Prediction of Free Fatty Acid Particle Formation in Biopharmaceutical Drug Products: Incorporating Ester Distribution during Polysorbate 20 Degradation. Mol Pharm. 2020, 17(11):4354–4363.
• Doshi N. et al., Evaluation of Super Refined™ Polysorbate 20 With Respect to Polysorbate Degradation, Particle Formation and Protein Stability. J Pharm Sci. 2020, 109(10):2986–2995.
• Martos A. et al., Novel High-Throughput Assay for Polysorbate Quantification in Biopharmaceutical Products by Using the Fluorescent Dye DiI. J Pharm Sci. 2020, 109:646.