Analysis of Subvisible and Visible Aggregation in Lentiviral Vectors with Aura GT System

Analýza subviditních a viditelných agregátů v lentivirových vektorech pomocí Aura GT System

Význam tématu:
Vývoj lentivirových vektorů (LVV) pro buněčné a genové terapie klade vysoké nároky na kontrolu stability a čistoty finálních přípravků. Agregace viditelných i subviditních částic je klíčovým kritickým parametrem kvality biologik, který ovlivňuje bezpečnost a účinnost léčivého přípravku. U LVV je analýza obtížnější kvůli jejich komplexní struktuře (lipidový obal, povrchové proteiny, nukleová kyselina) a omezenému množství materiálu dostupného během vývoje a optimalizace formulace. Rychlé, citlivé a prostorově úsporné metody pro kvantifikaci a identifikaci agregátů jsou proto zásadní pro formulaci, procesní vývoj a uvolňování šarží.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem aplikace bylo demonstrovat schopnost systému Aura GT k detekci, kvantifikaci a charakterizaci viditelných a subviditních částic ve vzorcích LVV při velmi malém odběru vzorku (až od 5 µL). Studie porovnala tři komerčně získané LVV kandidáty (označené jako Sample 1, 2 a 3) za účelem stanovení rozdílů v agregaci a ověření identity agregátů použitím fluorescenčních barviv specifických pro nukleové kyseliny a proteiny.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Předběžné obrazování prázdné černé membránové destičky pro získání referenčního pozadí.
• Nanesení vzorku (v praxi může být pro získání identifikace použito 20 µL, výrobce uvádí, že analýza je možná i při pouhých 5 µL) a opětovné snímání pomocí režimu backgrounded membrane imaging (BMI) pro kvantitativní a morfologickou analýzu částic.
• Analýza obrazů pomocí Particle Vue Software s proprietárním algoritmem pro detekci a kvantifikaci částic (počet, velikost, morfologie).
• Identifikační analýza pomocí fluorescence membrane microscopy (FMM): duplexní barvení SYBR Gold (nukleová kyselina) a thioflavin‑T (proteiny) pro odlišení částic obsahujících nukleová kyselina od čistě proteinových agregátů.

Použitá instrumentace:

• Aura GT System (Waters) — integrovaný systém pro BMI a FMM obrazování membránových jamek.
• Particle Vue Software — software pro automatizovanou analýzu obrazů a generování distribucí velikostí a intenzit fluorescence.
• Černé membránové destičky (well plates) pro zachycení částic a minimalizaci pozadí.
• SYBR Gold (Thermo Fisher, S11494) — fluorescenční barvivo selektivní pro nukleové kyseliny.
• Thioflavin‑T (Sigma‑Aldrich, T3516) — fluorescenční barvivo značí proteiny / amyloidní struktury (použito jako obecný proteinový barvicí prostředek).
• Imaging režimy: BMI pro detekci částic bez značení; FMM pro mapování fluorescence a identifikaci chemickobiologické povahy částic.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza tří vzorků ukázala výrazné rozdíly v profilu agregace:

• Sample 1: nejstabilnější – nejnižší počet subviditních a žádné viditelné částice (>100 µm). Velikostní rozdělení bylo nejmenší.
• Sample 3: střední stabilita – převážně částice <20 µm, ale přítomny i ojedinělé větší částice.
• Sample 2: nejméně stabilní – vysoká četnost částic napříč podkategoriemi; stovky viditelných částic/mL a tisíce subviditních částic/mL pro velikostní biny pod 25 µm. Konkrétně bylo detekováno přes 310 000 částic/mL větších než 10 µm, což výrazně překračuje běžná kritéria pro uvolnění dle USP a představuje potenciální bezpečnostní riziko.

FMM s použitím SYBR Gold ukázalo, že velká frakce částic ve vzorku 2 vykazuje signál nukleových kyselin. To indikuje, že agregáty obsahují virový genetický materiál a že dochází k poruše obalu/úniku nukleové kyseliny, která pak může fungovat jako nukleační centrum pro tvorbu větších agregátů. Tím se předkládá konkrétní možný kauzální mechanismus instability vzorku 2 oproti vzorku 1 a 3. Analýza morfologických parametrů pomohla rozlišit biologické agregáty LVV od možných extrinsic kontaminantů (např. skleněné či plastové částice).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší několik praktických výhod pro vývoj a kontrolu kvality LVV:

• Nízký odběr vzorku (až 5 µL), což je kritické u limitovaných materiálů v raných fázích vývoje.
• Rychlost — záznam celé jamky trvá řádově jednu minutu, umožňuje vysokopropustné skrínování formulací a procesních parametrů.
• Současné kvantitativní stanovení počtu a velikostní distribuce částic spolu s identifikací jejich chemicko‑biologické povahy (nukleová kyselina vs. protein), což usnadňuje root‑cause analýzu agregace.
• Užitečné pro formulaci, diagnostiku instability, porovnání kandidátů a rozhodování o dalším vývoji nebo nutných stabilizačních opatřeních.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a integrace do praxe:

• Kombinace obrazových metod s jinými ortogonálními technikami (např. NTA, SEC‑MALS, TEM/Cryo‑EM, DLS) pro komplexní charakterizaci agregátů.
• Rozšíření panelu fluorescenčních markerů pro detailnější rozlišení typů částic (např. lipidové barviva, specifické pro RNA/DNA sondy, konformační proteinové markery).
• Automatizace a integrace do workflow QC pro kontinuální sledování stability během výroby a skladování.
• Použití strojového učení pro vylepšenou klasifikaci obrázků a předikci stability na základě obrazových a morfologických parametrů.
• Standardizace metodik pro virové vektory a aktualizace regulačních směrnic reflektujících specifika LVV (hranice pro subviditní částice, požadavky na identifikaci).

Závěr

Studie ukázala, že Aura GT System je efektivní nástroj pro rychlé a šetřící analýzy subviditních a viditelných částic v lentivirových vektorech s kombinací BMI a FMM. Metoda umožňuje nejen počítání a velikostní rozdělení částic při velmi malém objemu vzorku, ale i identifikaci agregátů obsahujících nukleovou kyselinu, což je zásadní pro rozlišení biologické příčiny agregace od externích kontaminantů. V praxi může tento přístup urychlit formulaci a procesní vývoj, zlepšit root‑cause analýzu a podpořit rozhodování v oblasti kvality a bezpečnosti LVV produktů.

Reference

1. Gándara C., Affleck V., Stoll E.A. Manufacture of Third Generation Lentivirus for Preclinical Use, with Process Development Considerations for Translation to Good Manufacturing Practice. Human Gene Therapy Methods. 2018;29(1):1–15.
2. Milone M.C., O’Doherty U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 2018;32(7):1529–1541.
3. Stripecke R., et al. The use of lentiviral vectors in gene therapy of leukemia: combinatorial gene delivery of immunomodulators into leukemia cells by state‑of‑the‑art vectors. Blood Cells, Molecules & Diseases. 2003;31:28–37.
4. Jarraya B., et al. Dopamine gene therapy for Parkinson’s disease in a nonhuman primate without associated dyskinesia. Science Translational Medicine. 2009;1(2):2ra4.
5. Crespo‑Barreda A., et al. Viral and Nonviral Vectors for In Vivo and Ex Vivo Gene Therapies. In: Translating Regenerative Medicine to the Clinic. 2016; str. 155–177.
6. Rapidly Distinguish Protein from Non‑Protein Particles in Biologic Formulations. Waters Application Note. 2025;720009101.
7. AAV Aggregate Quantitation and Identification with the Aura System. Waters Application Note. 2025;720009095.