Aggregates analysis of a bispecific antibody using Orbitrap Excedion Pro BioPharma Hybrid mass spectrometer with extended mass range

Význam tématu

Aналýza agregací u bioterapeutik je klíčová pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a shody s regulatorními požadavky. Agregace ovlivňují farmakokinetiku, vazbu na cílové struktury a mohou zvyšovat riziko imunogenity. U bispecifických protilátek (BsAb) je situa ce komplikovanější než u klasických monoklonálních protilátek vzhledem k asymetrické architektuře, různým doménám a možným mis-pairingům. Potřeba metod, které přesně detekují a kvantifikují monomery, multimery a mis-paired izoformy za nativních podmínek, je proto v průmyslové a regulatorní praxi vysoká.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo prokázat schopnost hmotnostního spektrometru Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro BioPharma Hybrid s rozšířeným m/z rozsahem detekovat a charakterizovat agregáty bispecifické protilátky za nativních podmínek pomocí SEC–nMS. Studie porovnává analytický tok (analytical flow) a vysokoprůtokové separace s nízkoproudem do MS (high-flow separation + low-flow MS injection) pro zvýšení citlivosti a šetrnosti ionizace.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorek: stresovaná bispecifická protilátka (intakt 103,5 kDa; řetězce ~52 kDa a 51,5 kDa) poskytnutá spolupracovníkem.
• Chromatografie: SEC (MAbPac SEC-1, 5 µm, 4 × 150 mm) s mobilní fází 100 mM amonium acetátu, teplota 30 °C.
• Režimy separace: analytický tok 180 µL/min (12 min eluce) a high-flow separace s post-column splitem do MS (~10 µL/min) pomocí nanoViper Fingertight spojek pro jemnou ionizaci.
• MS: Orbitrap Excedion Pro BioPharma Hybrid s rozšířeným m/z rozsahem až do m/z 12 000 pro detekci velkých komplexů v nativním stavu; EASY-Spray zdroj a OptaMax Plus ion source byly testovány pro posouzení šetrnosti ionizace.
• Rozlišení: experimenty provedeny při vysokém rozlišení (R = 60 000) a nižším rozlišení pro high‑flow low‑flow nastavení (R ~ 3 750) pro porovnání citlivosti a šetrnosti.
• Software: zpracování dat a dekonvoluce proběhlo pomocí Thermo Scientific BioPharma Finder verze 5.4.

Hlavní výsledky a diskuse

Separační a analytické poznatky:

• Ve srovnání s monomerovou referencí (99 % monomer podle poskytovatele) vykazoval stresovaný vzorek pět separovaných chromatografických píků interpretovaných jako tetramer, trimer, dimer a dva monomerické pík y (monomer peak1 a peak2). Podíl monomeru ve stresovaném vzorku klesl na ~89 %, zvýšily se agregáty.
• Orbitrap Excedion Pro umožnil přímé snímání distribucí nábojových stavů velmi vysoké hmotnosti; tetramer byl detekován v rozsahu m/z ~8 500–10 000 s kontinuálními a normálně rozloženými nábojovými státy.
• Vyšší rozlišení (R = 60 000) zlepšilo rozlišení N‑glykoforem a napomohlo identifikaci mis-paired izomerů jak u monomeru, tak u agregátů.
• Porovnání analytického toku a high‑flow + low‑flow přístupu ukázalo podobné surové spektra, což naznačuje, že použitý ionizační režim OptaMax Plus/EASY‑Spray nezpůsobil disociaci agregátů.
• Snížení množství vzorku v low‑flow režimu (přibližně 1/18 množství) dosáhlo srovnatelné intenzity MS signálu pro dimer, což ukazuje zvýšenou citlivost této konfigurace.

Interpretace a relevan ce:

Detekce kompletního rozsahu nábojových stavů u tetrameru a dalších multimérů potvrzuje vhodnost rozšířeného m/z rozsahu pro analýzu velkých, slabě vázaných nativních komplexů. Identifikace mis-paired izomerů poukazuje na to, že stresové podmínky mohou indukovat nesprávné párování řetězců u BsAb, což má přímý vliv na kvalitu produktu a vyžaduje monitorování během vývoje a výroby.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody přístupu SEC–nMS s Excedion Pro:

• Přímé určení molekulových hmotností monomerů, multimérů a mis-paired variant bez nutnosti denaturace.
• Možnost sledování změn v distribu ci glykovaných forem a detailní charakterizace variabilit, které nejsou snadno dostupné jen z UV/SEC dat.
• Vysoká citlivost při low‑flow injekci umožňuje úsporu vzorku a lepší detekci nízkoabundantních agregátů.
• Uplatnění v kontrolách kvality (batch release), formulaci, stabilitním testování a vývoji procesů pro BsAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a integrace metod:

• Propojení nativní SEC–nMS s online buffer exchange pro automatizovanou, vyšší propustnost a snížení manuálních kroků.
• Rozšíření kombinací s iontovou mobilitou pro rozlišení konformačních izomerů agregátů.
• Využití ještě širších m/z rozsahů a lepšího rozlišení pro analýzu velkých komplexů a multimodálních agregátů.
• Integrace s top‑down přístupy a lokalizací modifikací pro hloubkovou strukturální charakterizaci mis‑paired a modifikovaných forem.
• Standardizace workflow pro regulato rní validaci a vyšší automatizace datové analýzy v BioPharma Finder a obdobných nástrojích.

Závěr

Studie demonstrovala, že Orbitrap Excedion Pro BioPharma Hybrid s rozšířeným m/z rozsahem a kombinací analytického SEC‑nMS a high‑flow separace s low‑flow injekcí je schopný spolehlivě separovat a identifikovat monomerické i multimerní formy bispecifické protilátky v nativních podmínkách. Metoda poskytuje vysokou citlivost, zachovává nativní agregáty při ionizaci a umožňuje rozlišit mis‑paired izoformy a glykované varianty, což ji činí hodnotným nástrojem pro vývoj a kontrolu kvality BsAb.

Reference

1. W. Liu, H. S. Jayasekera, J. D. Sanders, G. Zhang, R. Viner, M. T. Marty. Online Buffer Exchange Enables Automated Membrane Protein Analysis by Native Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2023, 95, 47.