Optimized bead-based enrichment workflow for high-throughput detection of low-abundant proteins for plasma proteomics

Význam tématu

Analýza plasmy je klíčová pro identifikaci biomarkerů v klinické a translační výzkumné praxi, protože krevní plasma obsahuje bohatý repertoár signálních molekul, cytokinů a tkáňově specifických proteinů. Hlavní analytickou překážkou je však velmi široké dynamické rozmezí koncentrací proteinů, kdy vysoce abundantní proteiny maskují nízkoodstupňové komponenty. Optimalizované obohacování nízkootáčkových proteinů proto zvyšuje hloubku proteomického pokrytí a citlivost při detekci potenciálních biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout a ověřit vysoce propustný (high-throughput) magnetický bead‑based workflow pro selektivní obohacení nízce abundantních proteinů z lidské plasmy a zajistit jeho robustnost, reprodukovatelnost a kompatibilitu s automatizací. Studie hodnotila: vliv poměru kuliček k vzorku, rozsah vstupních objemů plasmy (20–100 µl), porovnání formátů (tip vs. plate, manuálně vs. KingFisher automat), opakovatelnost mezi výrobními šaržemi a analytické výsledky získané pomocí DIA na moderních Orbitrap platformách.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnovalo magnetické obohacení nízce abundantních proteinů z 20–100 µl plasmy, následnou denaturaci, redukci, alkylaci, tryptickou digestaci a desalting. Klíčové technické komponenty a analytické postupy:

• Enrichment: komerčně dostupné magnetické beads optimalizované pro plasma proteomiku; testovány různé bead:sample poměry (1:1 až 1:8).
• Příprava vzorku: Thermo Scientific EasyPep MS workflow pro zpracování proteinů a čistění peptidů.
• Kvantifikace peptidů: Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay.
• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Neo UPLC se 50 cm nebo 15 cm C18 EASY‑Spray PepMap Neo kolonkou; gradient 3→28 % ACN přes 35 min, následně 28→35 % přes 12 min; průtok 300 nL/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid a Orbitrap Astral Zoom pro DIA analýzy; typická injekce 500 ng digestu na běh.
• Automatizace: KingFisher platforma pro zpracování v plátkovém formátu (plate) s porovnáním manuálního zpracování a tip‑based formátu.
• Software pro zpracování dat: Spectronaut 20.5 pro DIA analýzu a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný postup významně rozšiřuje hloubku plasmatického proteomu a prokazuje vysokou reprodukovatelnost:

• Proteomická hloubka: identifikováno přibližně 5 500–5 600 proteinů při obohacení 40 µl plasmy; v určitých nastaveních bylo dosaženo >5 500 proteinových ID.
• Reprodukovatelnost: koeficient variační (CV) u většiny proteinů a peptidů byl nízký — medián CV pro proteiny cca 8 % a pro peptidy cca 15 %; ~84 % proteinů a ~63 % peptidů mělo CV < 20 %.
• Technická konzistence: mezi různými šaržemi kuliček byly identifikace vysoce konzistentní (~5 600 proteinů) s velmi nízkými rozdíly mezi běhy (<1 % u některých měření identifikací).
• Vliv vstupního objemu a formátu: workflow fungoval stabilně v rozsahu 20–100 µl plasmy; tip i plate formáty vykazovaly srovnatelné výsledky (více než 3 600 proteinových ID s CV <1 % ve vybraných experimentech).
• Automatizace: implementace na KingFisheru umožnila udržitelnou automatizaci s výsledky srovnatelnými či lepšími než manuální zpracování (přes 3 900–4 100 proteinových ID a ~38 000–39 000 peptidových ID, CV často pod 10 %), přičemž došlo ke snížení laboratorního času a variability operátora.
• Optimalizace bead:sample poměru: poměry ≥1:2 vedly k robustní identifikaci >4 000 proteinů a nízkým CV, což ukazuje na praktický kompromis mezi výtěžností a spotřebou materiálu.
• Funkční pokrytí: GO analýza ukázala obohacení proteomů souvisejících se sekrecí a intracelulárním transportem, což odpovídá očekávanému složení plasmatického proteomu a potvrzuje selektivitu obohacení.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje několik významných benefitů pro translační proteomiku a biomarker discovery:

• Zvýšená citlivost pro nízce abundantní proteiny, které bývají relevantní pro onemocnění a terapii.
• Škálovatelnost a kompatibilita s automatizací (KingFisher) umožňující vysokou propustnost a zkrácení doby zpracování.
• Vysoká reprodukovatelnost mezi šaržemi a vstupy — vhodné pro projekty s velkým počtem vzorků a longitudinální studie.
• Kompatibilita s DIA strategií a moderními Orbitrapy zajišťuje přesnou kvantitativní analýzu a širší proteomické pokrytí při standardním vstupu 500 ng digestu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Optimalizovaný bead‑based přístup je dobře umístitelný do postupů, které budou dále zvyšovat biologickou a klinickou použitelnost plasmatických dat:

• Integrace s hlouběji cílenými metodami (PRM/SRM) pro validaci kandidátních biomarkerů získaných ve screeningu.
• Další škálování na 96/384 formáty s plnou automatizací pro populační studie a klinické kohorty.
• Využití pokročilých bioinformatických pracovních postupů pro dekonvoluci nízkou-abundantních signálů a integraci multi‑omics dat.
• Optimalizace pro specifické třídy proteinů (např. post‑translační modifikace, membrane‑associated proteiny) a adaptace k menšímu vstupnímu objemu pro pediatrické či mikro‑vzorky.

Závěr

Prezentované bead‑based obohacení plasmy představuje robustní, reprodukovatelný a vysoko‑propustný postup, který výrazně zlepšuje detekci nízce abundantních proteinů a umožňuje konzistentní kvantifikaci tisíců proteinů. Metoda je kompatibilní s automatizovanými platformami, moderními Orbitrap hmotnostními spektrometry a DIA analytikou, což ji činí vhodnou pro velké screeningové studie a translační biomarker discovery.

Reference

1. Flora A., Deyarmin J., Li Q., Samra S., Patel B. Optimized bead-based enrichment workflow for high-throughput detection of low-abundant proteins for plasma proteomics. Thermo Fisher Scientific, PO004674-2026-EN.