Comprehensive and high-throughput plasma proteome profiling for biomarker discovery

Význam tématu

Plazmatická proteomika nabízí jedinečný pohled na biologické procesy a umožňuje objevovat klinicky relevantní biomarkery. Díky přístupu k plazmatickým proteinům můžeme lépe pochopit onemocnění, sledovat průběh terapie a posunout personalizovanou medicínu na novou úroveň. Výzvou je široký dynamický rozsah koncentrací proteinů, který komplikuje detekci nízkoho množství proteinů a vyžaduje vysoce citlivé, robustní metody s minimalizovanou technickou variabilitou.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo otestovat výkonnost workflow pro plazmatickou proteomiku kombinující Orbitrap Astral Zoom hmotnostní spektrometr a Seer Proteograph ONE Assay. Studie porovnávala tři přístupy přípravy vzorku – neat plazma, imunodepletované plazma a workflow s nanopartiklovou selekcí (Proteograph ONE) – za různých rychlostí analýzy (100–24 vzorků/den) a zátěží kolony (200–1250 ng peptidů). Použity byly úzkooknové label-free DIA metody (nDIA) pro hluboké a precizní kvantifikace.

Použitá metodika

Vzorky humaní K2EDTA plazmy prošly třemi přípravami: jednoduché (neat), imunodepletací 14 nejhojnějších proteinů a kompresí dynamického rozsahu pomocí Seer Proteograph ONE nanopartikel. Peptidy byly připraveny na AccelerOme Automated Sample Preparation Platform, koncentrovány SpeedVacem a naneseny na Vanquish Neo UHPLC v konfiguraci trap-elute. Gradienty 24–100 SPD formovány 0,1 % kyselinou mravenčí ve vodě (A) a 80 % acetonitrilem (B). Data sbírána na Orbitrap Astral Zoom MS v režimu full scan a úzkooknové DIA s 24–3 m/z okny.

Hlavní výsledky a diskuse

Neutrální plazma při 24 SPD generovala ~9 000 peptidů a 1 165 proteinových skupin (CV proteiny 4,8 %), při 100 SPD ~5 500 peptidů a 682 proteinů (CV 5,6 %). Immunodepletace umožnila až 2× vyšší pokrytí (24 SPD až 2 403 proteinů, CV 4,8 %). Workflow Proteograph ONE rozšířilo hloubku 6× (24 SPD až 7 185 proteinů, CV 3,7 %) a identifikovalo 5 764 unikátních skupin. Enričment analýzy odhalily významné kategorie imunitních a krevních procesů, KEGG dráhy koagulace a metabolizmu. Porovnání s Human Plasma Peptide Atlas (4 608 proteinů) potvrdilo 54,9 % overlap a objevení ~4 964 nových proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

Populární immunodepletivní přístup a nanopartikelová komprese významně zvyšují detekci nízkomolekulárních a biologicky klíčových markerů. Orbitrap Astral Zoom MS poskytuje vysokou citlivost, rychlost a robustnost, což umožňuje analýzu velkých kohort (až 18 000 vzorků/rok při ≥60 SPD). Metoda kombinuje přesné kvantifikace a rozsáhlé pokrytí proteomu s minimem manuální práce a variabilit.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na plnou automatizaci přípravy vzorků, integraci multi-omics dat a aplikaci strojového učení pro interpretaci komplexních proteomických profilů. Rozšířená platforma slibuje nasazení v klinických studiích, personalizované léčbě a screeningových programech, kde vysoká propustnost a reprodukovatelnost otevřou cestu k validaci nových biomarkerů.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace Orbitrap Astral Zoom MS a Proteograph ONE Assay umožňuje flexibilní rozložení mezi rychlostí, hloubkou a přesností plazmatické proteomiky. Workflow podporuje široké spektrum aplikací od rychlého screeningu po ultrahluboké profilování, což významně zkracuje čas a náklady při zachování nejvyšší kvality dat.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer
• Vanquish Neo UHPLC system
• Seer Proteograph SP200 Automation Instrument
• Thermo Scientific AccelerOme Automated Sample Preparation Platform
• Thermo Scientific Savant SpeedVac Concentrator
• EASY-Spray HPLC a PepMap Neo UHPLC kolony
• High Select Depletion Spin columns

Reference

• Ignjatovic V. et al. J Proteome Res. 2019;18(12):4085–4097.
• Anderson N.L., Anderson N.G. Mol Cell Proteomics. 2002;1(11):845–867.
• Geyer P.E. et al. EMBO Mol Med. 2019;11(11):e10427.
• Blume J.E. et al. Nat Commun. 2020;11(1):3662.
• Geyer P.E. et al. J Proteome Res. 2024;23(12):5279–5295.
• Anderson N.L. Clin Chem. 2010;56(2):177–185.