Unveiling hidden protein depths: a high-throughput plasma proteomics workflow for enhanced biomarker discovery

Význam tématu

Proteomika plazmy se uplatňuje při hledání biomarkerů pro včasnou diagnostiku onemocnění, zejména rakoviny. Díky snadnému odběru se plazma stává ideálním vzorkem pro velké kohortní studie, avšak široký rozptyl koncentračních hladin bílkovin vyžaduje pokročilé analytické přístupy a citlivé přístroje pro odhalení nízce abundentních markerů.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři si stanovili za cíl navrhnout robustní a vysoce výkonné pracovní postupy pro hlubokou proteomickou analýzu lidské plazmy a zlepšit kvantitativní výkonnost pomocí label-free data-independent acquisition (DIA) na přístroji Thermo Scientific Orbitrap Astral.

Použitá metodika a instrumentace

Studie porovnává čtyři přístupy k přípravě vzorku plazmy:

• Neředěná (neat) plazma bez úprav pro maximální průchod vzorku.
• Deplece 14 nejabundantnějších bílkovin pomocí spin sloupců Thermo Scientific High Select.
• Obohacení proteomické frakce pomocí Seer Proteograph XT nanopartikelového workflow.
• Dílčí frakcionace peptidů pro hlubší průzkum proteomu.

Pro chromatografii byly použity systémy Vanquish Neo UHPLC a sloupce EASY-Spray PepMap, pro hmotnostní spektrometrii Orbitrap Astral a pro automatizaci platforma Seer SP100. Detekce probíhala v režimu DIA s optimalizovanými metodami o průtoku až 100 vzorků denně.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow bez úprav umožnilo za 60 vzorků/den identifikovat průměrně 718 proteinových skupin s CV kolem 6 %, avšak citlivost k nízkoabundantním bílkovinám byla omezená. Depletační přístup zvýšil identifikaci až na 1 857 proteinů při 24 vzorcích/den a 1 380 proteinů při 60 vzorcích/den (CV ≈ 6–10 %). Nanopartikelové obohacení umožnilo detekci až 6 457 proteinových skupin při 24 vzorcích/den a 4 880 proteinů při 60 vzorcích/den, čímž dosahuje nejhlubšího pokrytí proteomu plazmy. Zahrnutí projektově specifické spektrální knihovny využívající frakcionaci zlepšilo pokrytí o dalších 300–600 proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

Sestavené pracovní postupy nabízejí vyvážený poměr mezi rychlostí analýzy a hloubkou proteomického pokrytí. Vysok throughput až 100 vzorků/den umožňuje rozsáhlé studie s vysokou reprodukovatelností a citlivostí. Výběr mezi neat, depleční nebo nanopartikelovou metodou závisí na požadavku na hloubku analýzy a rozpočet.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem vývoje bude integrace umělé inteligence pro adaptivní výběr spekter, využití ještě rychlejších chromatografických sloupců a rozšíření spektrálních knihoven o vzácné nebo modifikované proteiny. Adaptace workflow na klinické platformy a validace markerů v reálných pacientech podpoří implementaci do rutinní diagnostiky.

Závěr

Orbitrap Astral ve spojení s různými přístupy k přípravě vzorku představuje průlom v hluboké a vysoce výkonné proteomické analýze plazmy. Poskytuje nástroje pro spolehlivou detekci nízce abundentních biomarkerů ve velkých kohortách a otevírá cestu k rychlejší a cílenější diagnostice.

Reference

1. Deutsch J. et al., Advances and Utility of the Human Plasma Proteome. J. Proteome Res. 2021, 20(12), 5241–5263.
2. Huang T. et al., Protein Coronas on Functionalized Nanoparticles Enable Quantitative and Precise Large-Scale Deep Plasma Proteomics. bioRxiv 2023.
3. Woo J.; Zhang Q., A streamlined high-throughput plasma proteomics platform for clinical proteomics with improved proteome coverage, reproducibility, and robustness. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2023, 34(4), 754–762.
4. Geyer P. et al., Plasma proteome profiling to assess human health and disease. Cell Syst. 2023, 2(3), 185–195.