Low-resolution FAIMS for increased peptide coverage in low-load and single-cell proteomics

Význam tématu

Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry (FAIMS) se běžně používá v low-input a single-cell proteomice ke snížení chemického pozadí a zvýšení selektivity před vlastním hmotnostním spektrometrem. Nicméně volba provozního režimu FAIMS představuje kompromis mezi selektivitou a přenosovou účinností iontů: použití jediného kompensačního napětí (CV) je rychlé a kvantitativně stabilní, ale může omezit pokrytí peptidů. Studie zkoumá jednoduché provozní vylepšení – snížení „resolution“ FAIMS úpravou teploty vnější elektrody – jako způsobu zvýšení iontového toku a tím i identifikací u nízkých nábojů vzorku až po jednotlivé buňky, bez nutnosti prodlužovat duty cycle nebo používat více CV.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo ověřit, zda úmyslné snížení rozlišení FAIMS (prostřednictvím snížení teploty vnější elektrody z 100 °C na 80 °C) zvýší přenos iontů a tím počet identifikací peptidů a proteinů v nízkonaložních vzorcích a single-cell experimentech, a to při zachování výhod provozu s jedním CV. Studie porovnává standardní a nízké rozlišení napříč sérií HeLa digestů (250 pg–16 ng) a skutečnými izolovanými buňkami H460.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Hodnocení FAIMS resolution: vstřikování FlexMix kalibračního roztoku a sledování CV rozložení pro několik vybraných iontů (m/z 322, 524, 622, 922).
• Analytické experimenty: srovnání vnější elektrody FAIMS při 100 °C (standard) vs. 80 °C (nízké rozlišení).
• Vzorkové série: HeLa digest titrace 250 pg–16 ng; jednotlivé H460 buňky izolované a zpracované one‑pot protokolem v 384‑well destičce; 0‑cell kontroly zahrnuty jako pozadí.
• MS režimy: DIA měření s optimalizovanými šířkami oken a maxIT podle zatížení; u single cell použití 20 Th oken a maxIT 40 ms.
• Datové zpracování: Spectronaut v20.1, vyhledávání proti UniProt (UP000005640, reviewed) + CRAPome, FDR 1 % na úrovni proteinů; kvantifikace na úrovni MS1; u single‑cell aplikován filtr min. kvantity 10 pro odstranění šumu.

Použitá instrumentace:

• UHPLC: Thermo Neo UHPLC; trap kolona PepMap C18 (5 mm × 300 μm i.d.), separace na Aurora Rapid 8×75 XT C18 (50 °C).
• MS: Thermo Orbitrap Astral mass spectrometer se zdrojem EASY‑Spray a rozhraním FAIMS Pro Duo.
• FAIMS parametry: pevné CV –48 V; nosný proud plynu 3.5 L/min; srovnání outer electrode teplot 100 °C vs. 80 °C.
• Příprava vzorků / single‑cell: cellenONE robot (One‑Pot protokol), lýza a tryptická digestace v 384‑well (podmínky: 40 °C/70 % RH 30 min + následných 1.5 h po doplnění trypsinu), použití 0.2 % DDM a TEAB při lyzi.
• Standardní materiály: Thermo Pierce HeLa peptides rozpuštěné v 0.1 % TFA + 0.015 % DDM.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• Snížení teploty vnější elektrody na 80 °C rozšiřuje CV peaky (nižší „resolution“) a zvyšuje integrovaný průtok iontů přes FAIMS u testovacích iontů FlexMix; pro některé m/z bylo pozorováno zvýšení peak area o ~18–21 %.
• V 250 pg HeLa digestu došlo k výraznému navýšení identifikovaných peptidů: ze 28 063 (standard) na 35 258 při 80 °C (+25.6 %). Počet identifikovaných proteinů a sumární proteinové kvantity se rovněž zvyšovaly.
• Při titraci vstupu (250 pg–16 ng) vyšší ionový tok při nízkém rozlišení vedl k nárůstu peptidových identifikací o 14–34 % napříč všemi zatíženími; největší relativní zisk byl při nejnižším zatížení (250 pg): až +34 % peptidů a +10 % proteinů.
• Nastavení menších DIA oken spolu s kratšími maxIT výhodně využila zvýšený ion‑flux u nízkého rozlišení – zúžení oken zlepšilo počet peptidových identifikací u low‑resolution FAIMS, zatímco u standardního režimu většinou snižovalo identifikace.
• U single‑cell experimentů (H460) bylo dosaženo zvýšení průměrných identifikací peptidů o ~21 % a proteinů o ~4 % při nízkém rozlišení. 0‑cell kontroly potvrdily, že získaná zvýšení jsou důsledkem citlivosti na nízkou abundanci, nikoli artefaktu zpracování.
• Charakteristika prekursorů: snížení rozlišení neovlivnilo retence výrazně, zaznamenal se jen mírný posun mediánu m/z; mírné zvýšení podílu +3 nabitých iontů u low‑resolution bylo pozorováno, zejména při vyšších vstupech.
• Quantitativní kvalita: zvýšený ionový počet v MS1/MS2 vedl ke zlepšení kvantitativní preciznosti (nižší koeficienty variability) u vzorků měřených při sníženém rozlišení.

Diskuse:
Studie ukazuje, že úmyslné snížení selektivity FAIMS rozšiřuje okno přenosu iontů a tím zmírňuje ztráty peptidů způsobené agresivním filtrováním. Výhodou je jednoduchost a okamžitý přínos pro citlivost u nízkých vstupů bez nutnosti prodlužování instrumentálního cyklu (více CV) nebo zásadních změn v analytickém workflow. Nevýhodou může být snížená selektivita vůči chemickému pozadí za určitých okolností, což ale v kontextu této studie vedlo spíše ke zisku signálu než ke zvýšení šumu.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické implikace a doporučení:

• Pro analýzy s extrémně nízkým zatížením vzorku (single cell, sub‑ng) lze za účelem maximalizace počtu identifikací zkusit snížit vnější teplotu FAIMS na ~80 °C.
• Je vhodné přizpůsobit DIA šířky oken a maximální injekční časy (maxIT): při vyšším ion‑fluxu postačí kratší maxIT a užší okna, čímž se získá lepší selektivita bez ztráty citlivosti.
• Zachování jednoduchosti provozu s jedním CV ponechává benefit kratšího duty cycle a stabilnější kvantifikace ve srovnání s multi‑CV strategiemi.
• Postup je snadno implementovatelný na přístrojích vybavených FAIMS bez nutnosti dalšího hardwaru nebo zásadních změn v datovém zpracování.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje:

• Systematické prozkoumání trade‑offu mezi zvýšeným ion‑fluxem a potenciálním nárůstem nepříznivého pozadí v různých matricích (např. buněčné lyzáty vs. biologické tekutiny).
• Optimalizace kombinovaných strategií: adaptivní používání nízkého rozlišení pro nízkonaložní segmenty analýzy a standardního rozlišení pro větší zatížení, případně dynamické přepínání parametrů podle očekávaného ionového toku.
• Integrace s pokročilými algoritmy zpracování dat, které využijí zvýšeného počtu fragmentních iontů pro lepší identifikace a kvantifikaci při zachování kontroly FDR.
• Rozšíření testů na širší spektrum buněčných typů a klinických vzorků k ověření robustnosti metody v heterogenních populacích a při různých vzorcích zpracování.

Závěr

Studie dokládá, že jednoduché snížení FAIMS rozlišení prostřednictvím snížení teploty vnější elektrody (z 100 °C na ~80 °C) účinně zvyšuje přenos iontů, což vede k podstatnému nárůstu peptidových i proteinových identifikací u nízkonaložních vzorků včetně single‑cell experimentů. Tento přístup poskytuje nákladově efektivní a snadno implementovatelnou optimalizaci ke zlepšení citlivosti a kvantitativní kvality bez nutnosti zásadních změn v přístrojovém vybavení nebo workflow.

Reference

1. Hoch DG, Belford M, Heil LR et al. Low‑resolution FAIMS for increased peptide coverage in low‑load and single‑cell proteomics. Sci Rep. 2026.