Balancing speed and depth: Doubling throughput in single-cell proteomics using Orbitrap Astral Zoom MS

Význam tématu

Single-cell proteomika umožňuje studium proteinové variability mezi jednotlivými buňkami a je klíčová pro pochopení biologické heterogenity v základním výzkumu i klinických aplikacích. Hlavní překážkou širší aplikace je kompromis mezi hloubkou proteomu a průchodností (počet vzorků za den). Studie popisuje optimalizovaný workflow založený na Orbitrap Astral Zoom MS a Vanquish Neo UHPLC, který zdvojnásobuje průchodnost při minimálním poklesu identifikací a bez výrazné ztráty kvantitativní přesnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo navrhnout a otestovat LC‑MS metodiku pro nízké nálože a jednotlivé buňky, která maximalizuje počet analyzovaných vzorků za den (SPD) při zachování hlubokého proteomického pokrytí a robustní kvantifikace. Autoři optimalizovali chromatografické gradienty, MS akviziční parametry a podmínky FAIMS a ověřili výkonnost na HeLa digestech (diluce 10–1000 pg), tří‑proteomovém benchmarku (HYE) a na reálných HeLa single buňkách.

Použitá metodika a instrumentace

Hlavní instrumentace a klíčové parametry:

• HPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC; hlavně Aurora Rapid 8×75 XT (8 cm) kolona; pro některé podmínky použita 25 cm Aurora (IonOpticks / Aurora XT).
• MS: Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer v režimu "Low Input"; Thermo Scientific FAIMS Pro Duo rozhraní.
• FAIMS: kompenzační napětí CV = −48; carrier gas 3.5 L/min; v rámci optimalizace se měnila teplota vnější elektrody (100 → 80 °C), optimálně 80 °C pro vyšší počet peptidů.
• Akviziční nastavení: pro vysokou průchodnost (100–160 SPD) použito 10 Th izolace a 20 ms injekční doby; pro nižší průchodnost (50–80 SPD) použito 20 Th a 40 ms.
• Datová analýza: Biognosys Spectronaut 20.5, directDIA (library‑free); databáze UniProt Human pro běžné analýzy; pro tří‑proteomový benchmark použity zároveň human/yeast/E.coli FASTA. Kvantifikace nastavena na MS1, normalizace podle human FASTA.
• Příprava vzorků: bulk HeLa digest (Pierce) a single HeLa buňky připravené pomocí CellenONE workflow; použití 0.015% DDM a 0.1% TFA při re‑konstituci; HYE mixy připraveny jako Mix A (65 % H / 30 % Y / 5 % E) a Mix B (65 % H / 15 % Y / 20 % E).

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění:

• Zdvojnásobení průchodnosti: přechod z 50 → 100 SPD a z 80 → 160 SPD byl dosažen s pouhým ~7–10 % poklesem v počtu identifikovaných proteinových skupin při 250 pg náloži.
• Identifikace při nízkých náložích: při 160 SPD bylo identifikováno 3 076 proteinových skupin z pouhých 10 pg HeLa digestu (n = 3) s dobrou reprodukovatelností; 250 pg dalo >5 647 proteinových skupin při 160 SPD a >6 030 proteinových skupin při 100 SPD. Při 1 ng vzorku se počet zvyšoval na ~6 300 proteinových skupin.
• Single‑cell data: reálné HeLa single buňky analyzované bez booster kanálu a bez spektrální knihovny poskytly v průměru 5 808 proteinových skupin a 48 910 peptidů při 100 SPD; i při 160 SPD bylo detekováno >5 200 proteinových skupin v průměru (~5 240 uváděno v textu).
• Kvantitativní přesnost a preciznost: v dilučním seriálu (10–1000 pg) se podíl proteinových skupin s CV < 20 % zvyšoval na 80–85 %; medián CV napříč metodami byl ≤ ~8 %. Benchmark HYE ukázal kvantitativní přesnost v rámci ~2 % pro E. coli a ~5 % pro yeast vs. očekávané poměry.
• Optimalizace FAIMS: snížení teploty vnější elektrody na 80 °C zvýšilo počet detekovaných peptidů (včetně modifikovaných) při zachované počtu proteinových skupin; proto 80 °C považováno za kompromis pro lepší peptidovou pokrytost.

Diskuse: Kombinace krátkých gradientů a rychlých akvizičních oken Astral Zoom MS umožnila významné zvýšení průchodnosti bez zásadního kompromisu v hloubce proteomu nebo kvalitě kvantifikace. Volba akvizičních parametrů (izolační šířka, injekční čas) byla klíčová pro vyvážení mezi detekcí peptidů a rychlostí skenování.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Výrazné zvýšení počtu vzorků za den při zachované schopnosti detekovat tisíce proteinových skupin z single‑cell nebo sub‑nanogramových vzorků — vhodné pro studie s velkým počtem buněk nebo stochastických populací.
• Library‑free directDIA workflow zjednodušuje přístupnost a zkracuje dobu analýzy bez nutnosti vytvářet rozsáhlé spektrální knihovny.
• Vysoká kvantitativní přesnost a nízké CV umožňují srovnatelné LFQ analýzy mezi experimenty i při zkrácených gradientech.
• Parametry FAIMS a teplota vnější elektrody poskytují další páku pro zlepšení peptidového pokrytí zejména u nízkých náložů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a aplikace:

• Přesun k ještě vyšší paralelizaci a automatizaci přípravy single‑cell vzorků (např. integrace CellenONE a robotizovaných workflow) umožní masivní n‑tá měření populace buněk.
• Důležitá bude další optimalizace akvizičních režimů Astral/FAIMS pro specifické třídy peptidů (např. fosfoproteomika) a pro minimalizaci chyb v detekci nízko‑a bází expresivních proteinů.
• Rozvoj hybridních přístupů kombinujících library‑free DIA s rychlými in‑silico generovanými knihovnami může dále zvýšit citlivost a identifikační pokrytí.
• Širší adopce ve vědeckých a klinických laboratořích: zvýšená průchodnost a robustní kvantifikace činí metodu atraktivní pro studie zpracovávající stovky až tisíce jednotlivých buněk, např. v onkologii, imunologii nebo vývoji léčiv.

Závěr

Studie demonstruje, že kombinace Orbitrap Astral Zoom MS s optimalizovaným UHPLC a FAIMS umožňuje zdvojnásobit průchodnost analýz pro low‑input a single‑cell proteomiku s pouze mírným poklesem v počtu identifikací a bez zásadního zhoršení kvantitativní přesnosti. Optimalizovaná sada parametrů (akvizice, FAIMS, chromatografie) poskytuje vyvážené řešení pro vysoce průchodné studie, které vyžadují stále hluboký a spolehlivý proteomický profil jednotlivých buněk.

Reference

1. Tabiwang N. Arrey et al. Enhanced sensitivity of the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for deeper proteome coverage in single-cell proteomics. Technical Note 004019.
2. Haoran Huang et al. Orbitrap Astral mass spectrometer allows comprehensive proteome coverage at the single-cell level. Technical Note 003350.
3. Hoch, D.G., Belford, M., Heil, L.R. et al. Low-resolution FAIMS for increased peptide coverage in low-load and single-cell proteomics. Sci Rep 16, 14454 (2026).