Unveil plasma proteomics with cutting-edge hybrid-DIA methods utilizing two strategies on the Orbitrap Astral Zoom MS

Význam tématu

Hybridní přístupy kombinující cílenou kvantifikaci peptidů s daty nezávislého skenování (DIA) představují klíčové řešení pro translacní proteomiku. Umožňují současně zachovat široký přehled proteomu a současně dosáhnout vysoké citlivosti a přesnosti pro předem definované biomarkery. To je zvláště důležité v klinických a ověřovacích studiích, kde je třeba rychle přecházet od objevování ke kvantifikaci při omezeném množství vzorku a nutnosti vysoké reprodukovatelnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a otestovat hybridní-DIA metody, které integrují cílenou PRM kvantifikaci s DIA objevnou analýzou na Orbitrap Astral Zoom hmotnostním spektrometru. Autoři porovnali dvě strategie: klasickou sekvenci MS1 → cílené MS2 → DIA (tMS2 hybrid-DIA) a DIA kombinovanou s on-the-fly spouštěním SureQuant PRM skenů (SureQuant hybrid-DIA). Hodnoceny byly dopady cílených PRM experimentů na pokrytí proteomu v rámci DIA a naopak vliv DIA na citlivost cílených měření.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika a vzorkování:

• Standardizovaná sada PQ500 peptidů (Biognosys) použitá jako cílené standardy; digesce lidské plazmy provedená pomocí AccelerOme; vzorky plazmy dodány BioIVT a sloučeny do matrice.
• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC s EASY-Spray ES906 kolonou v trap-and-elute režimu, teplota 50 °C; mobilní fáze A = 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, B = 0,1 % kyselina mravenčí v 80 % acetonitrilu. Gradienty optimalizovány pro analýzu plazmy.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Astral Zoom (detektor Astral) s dvěma konfiguračními strategiemi: tMS2 hybrid-DIA (MS1, cílené MS2, DIA) a SureQuant hybrid-DIA (SureQuant PRM + DIA). Klíčové instrumentální parametry byly optimalizovány (vysoké rozlišení Orbitrap, izolace v rozmezí jednotek m/z pro cílená skenování, krátké injekční doby pro DIA, HCD kolizní energie ~25 %).
• Datová analýza: RAW soubory konvertovány HTRMS konvertorem; DIA data vyhodnoceno ve Spectronaut 20.1; PRM data (vč. SureQuant) zpracováno ve Skyline.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pokrytí proteomu: Hybridní metody udržely vysokou hloubku proteomického pokrytí, přesto s drobným snížením oproti standardní DIA. Průměrné snížení počtu proteinových skupin bylo přibližně 9,5 % pro tMS2 hybrid-DIA a 12,8 % pro SureQuant hybrid-DIA; snížení počtu peptidů činilo průměrně 4,2 % (tMS2) a 6,7 % (SureQuant).
• Reprodukovatelnost: Koeficienty variability (CV %) pro proteinové skupiny byly nízké — <8 % u tMS2 a 5–7 % u SureQuant hybrid-DIA, což indikuje dobrou kvantitativní stabilitu mezi opakovanými injekcemi.
• Srovnání cílené citlivosti: Intenzity cílených peptidů v hybrid-DIA byly mírně nižší než u standardního PRM — přibližně 10 % pokles vůči PRM a ~13 % pokles vůči SureQuant PRM. Nicméně korelace intenzit mezi hybridními a standardními PRM metodami byla silná (Pearson R > 0,97 pro proteiny), což svědčí o konzistentním kvantitativním chování.
• Senzitivita: Orbitrap Astral Zoom dosáhl výborné citlivosti u cílených peptidů v hybridním režimu — více než 92 % peptidů mělo LOD pod 25 amol a více než 82 % mělo LOQ pod 50 amol.
• Interakce DIA a PRM: Zařazení DIA skenu do sekvence neovlivnilo výrazně citlivost PRM měření, a přítomnost PRM skenů neomezila výrazně schopnost DIA identifikovat proteiny a peptidy v rámci experimentu.

Přínosy a praktické využití metody

• Hybrid-DIA umožňuje současnou detekci a kvantifikaci cílených biomarkerů při zachování šíře objevné DIA analýzy, což zkracuje pipeline od objevování k ověření a šetří vzorky a čas.
• Vhodné pro translacní a klinické studie, kde je potřeba současně sledovat velký počet kandidátních markerů a zároveň mít kontext celého proteomu pro interpretaci změn.
• Díky vysoké reprodukovatelnosti a nízkým LOD/LOQ lze metodu využít pro monitorování slabě zastoupených signálů a pro sledování změn napříč širokým dynamickým rozsahem koncentrací v plazmě.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace načasování a plánování cílených skenů může minimalizovat drobné ztráty v pokrytí proteomu a dále zlepšit souběžné získávání dat.
• Integrace pokročilých rozhodovacích algoritmů (AI/ML) pro on-the-fly volbu kandidátů k PRM může zvýšit flexibilitu a informační výstup jedné analýzy.
• Rozšíření hybridního přístupu na vyšší throughput, automatizované workflowy a standardizaci pro klinickou aplikaci, včetně validace napříč centry, je přirozeným dalším krokem.
• Možné technické rozšíření kombinací s iontovou mobilitou nebo jinými separačními technikami pro zvýšení selektivity a citlivosti v komplexních matricích.

Závěr

Hybridní-DIA přístupy implementované na Orbitrap Astral Zoom MS představují praktický kompromis mezi širokou objevnou analýzou a vysoce citlivou cílenou kvantifikací. Studie ukazuje, že je možné integrovat PRM skeny bez výrazné ztráty pokrytí proteomu a zároveň udržet vysokou citlivost a reprodukovatelnost cílených měření. Tento koncept zrychlí přechod od objevování biomarkerů k jejich ověřování a nasazení v klinických studiích.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer (detektor Astral).
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC s EASY-Spray HPLC ES906 kolonnou.
• Standards and reagents: PQ500 peptidová sada (Biognosys), plasmatické vzorky BioIVT, AccelerOme digesce.
• Software a nástroje: HTRMS konvertor, Spectronaut 20.1 pro DIA vyhodnocení, Skyline pro PRM/SureQuant zpracování.

Reference

• Li Q., Deyarmin J., Steigerwald S., Samra S. Targeted Proteomics: Unveil plasma proteomics with cutting-edge hybrid-DIA methods utilizing two strategies on the Orbitrap Astral Zoom MS. Thermo Fisher Scientific Application Note, 2026.
• Biognosys. PQ500 peptide kit, produktové informace.
• BioIVT. Human plasma sample sourcing.
• Thermo Fisher Scientific. Vanquish Neo UHPLC, EASY-Spray ES906 column, Orbitrap Astral Zoom MS, software Spectronaut and Skyline, produktové informace.